Implication du système racinaire dans la défense de la pomme de terre

III.2.1. Production des espèces réactives d’oxygènes (ROS)

Dans un premier temps nous avons envisagé de déterminer si les BC de pomme de terre

sont capables de percevoir un éliciteur et d’induire une réponse immunitaire. Pour ce faire, la

production des espèces réactives d’oxygènes (ROS) sont choisies comme marqueur. Chez les

plantes, les ROS sont produites très rapidement lors d’un stress.

La mise en évidence des ROS est effectuée sur des plantules de pomme de terre issues de

graines. Les racines sont élicitées avec une préparation inactivée de P. atrosepticum à

2 mg/ml. L’observation de la fluorescence indiquant la production de ROS est permise par

l’utilisation d’une sonde fluorescente la CMH

DCFDA.

Après cinq minutes d’élicitation, une fluorescence de faible intensité apparait à

l’extrémité de la coiffe témoignant de la production de ROS. Cette fluorescence va

s’intensifier progressivement suite à la production de ROS de la quasi-totalité des BC et de

l’apex racinaire au bout d’une trentaine de minute (Figure III.9).

Le contrôle négatif de l’expérimentation est effectué sur des plantules traitées avec de

l’eau stérile en lieu et place de l’éliciteur. Aucune fluorescence n’est apparue au bout de 5

minutes de traitement. Une faible intensité de fluorescence apparait uniquement sur les apex

racinaires après 25 minutes (Figure III.10). Cette production peut résulter de la manipulation

de la plante ou de l’effet direct du laser du microscope confocal sur la plantule.

Ainsi, ces résultats mettent en évidence que les BC des plantes de pomme de terre sont

capables de percevoir un éliciteur et d’y répondre. Toutefois la production de ROS est une

réponse générale, ce qui laisse envisager l’utilisation d’un autre marqueur de défense plus

spécifique, en l’occurrence l’accumulation de callose (cf. paragraphe III.3), ou encore la

présence d’ADN extracellulaire.

Figure III.11 : ADNex dans le mucilage racinaire des plantules de pomme de terre par

coloration au Sytox Orange.

Les photos A, B et C représentent différents morphotypes d’ADNex observés dans le

mucilage de vitroplants de la pomme de terre.

III.2.2. Présence d’ADN extracellulaire dans les sécrétions racinaires

L’ADN extracellulaire (ADNex) a été démontré comme étant un élément clé de la

formation du Root Extracellular Trap (RET) et participe activement à la défense racinaire

(Wen et al., 2009 ; Driouich et al., 2013). A l’heure actuelle, aucune donnée n’est disponible

dans la littérature sur la présence d’ADNex chez la pomme de terre.

La recherche de cet ADNex chez la pomme de terre est effectuée sur du mucilage collecté

autour de la coiffe racinaire et des cellules bordantes de plantules issues de culture d’explants.

Au bout d’une dizaine de minutes d’incubation avec du Sytox Orange, sonde qui marque de

façon spécifique les molécules d’ADN, la fluorescence peut être observée (Figure III.11).

L’observation au microscope confocal à balayage laser des lames sur lesquelles le mucilage

est ensuite étalé met en évidence des structures filamenteuses fluorescentes (excitation du

Sytox Orange par le laser à 543 nm). De par leur aspect et leur forme, ces structures sont

semblables à celles publiées par Wen et al. (2009) et défini comme étant de l’ADN

extracellulaire.

Le mucilage racinaire des plantules de pomme de terre pourrait ainsi avoir un rôle de

piège extracellulaire (RET) vis-à-vis des pathogènes telluriques. En effet, les exsudats

racinaires jouent un rôle capital dans la régulation de la communauté de microorganismes

autour de la racine dans la rhizosphère (Dundek et al., 2011 ; Carvalhais et al., 2015). Par

ailleurs, la coloration au rouge de ruthénium révèle une importante couche de mucilage

entourant les BC et l’apex racinaire de la plante de pomme de terre. Ce mucilage pourrait être

composé, comme dans le cas des autres plantes étudiées jusqu’alors, des exsudats racinaires

provenant principalement des BC et de la coiffe racinaire (Driouich et al., 2013).

Egalement, en 2006, Yao et al. ont montré que les exsudats racinaires participent à la

virulence des bactéries pathogènes en favorisant leur attraction par chimiotactisme dans le cas

du pathosystème R. solanacearum - Lycopersicon Solanum.

Afin de déterminer l’implication des exsudats racinaires de la pomme de terre dans les

interactions avec les pathogènes, un test de chimiotactisme utilisant P. atrosepticum comme

pathogène modèle a été mis en place.

Figure III.12 : Dispositif expérimental pour la mise en évidence du chimiotactisme des

exsudats racinaires de pomme de terre sur P. atrosepticum.

Les puits C1 et C2 permettent le dépôt des composés à tester et le puits B, le dépôt des

bactéries une heure après le dépôt des composés C1 et C2.

Figure III.13 : Mise en évidence du chimiotactisme des exsudats racinaires de pomme de

terre sur P. atrosepticum.

A) Un développement bactérien observé dans le puits (E) correspondant au puits contenant les

exsudats racinaires de pomme de terre après une incubation de trois jours à 25°C. Aucun

développement bactérien n’est observé dans le puits (T) contenant de la tétracycline. B)

Contrôle négatif de l’expérimentation sur lequel aucun développement bactérien n’est observé

dans les puits avec dépôt d’eau stérile. Les bactéries restent dans leur puits initial de dépôt.

III.2.3. Chimiotactisme des exsudats racinaires de pomme de terre

vis-à-vis de P. atrosepticum

Le dispositif expérimental utilisé est représenté sur la Figure III.12. Trois puits

équidistants sont découpés directement dans le milieu gélosé d’une boite de pétri. Les

composés à tester sont ensuite déposés dans les deux puits de chaque extrémité opposée (C1

et C2). Après environ 1h à 25°C, les composés auront diffusé dans la gélose autour du puits.

Une suspension bactérienne est ensuite déposée dans le puits central (B). Après incubation

pendant 72 heures à 25°C, les boites sont observées. Un chimiotactisme positif se traduira par

le mouvement des bactéries du côté des produits C1 ou C2. Quant au chimiotactisme négatif,

il se traduit par le stationnement des bactéries dans le puits de dépôt (B).

Ce dispositif est utilisé comme suit : en C1, dépôt de tétracycline (T) ou d’eau stérile

(Contrôle), en C2 dépôt des exsudats racinaires de vitroplants (Figure III.13). Après dépôt

des bactéries dans le puits B et 3 jours d’incubation, un important développement bactérien

dans le puits E (Exsudat) est observé. Par contre aucun développement bactérien n’est observé

dans le puits T (Tétracycline) (Figure III.13-A). Le développement des bactéries dans le

compartiment (E) témoigne ainsi d’un chimiotactisme positif de P. atrosepticum contenue

dans le puits (B) vers le puits (E). Un contrôle négatif est effectué en déposant de l’eau stérile

dans les deux puits autour du puits de dépôt de bactéries. Dans ces conditions, aucun

mouvement chimiotactique n’est observé et les bactéries restent immobiles dans le puits de

dépôt (Figure III.13-B).

L’obtention de ces résultats nous a conduit à analyser la composition en monosaccharides

des exsudats racinaires de pomme de terre afin de pouvoir déterminer le composé responsable

de cet effet chimiotactique. Nous avons également cherché à déterminer l’effet de ces

exsudats sur le développement de la phytobactérie P. atrosepticum. L’ensemble de ces

résultats est présenté sous forme d’article scientifique dans la partie suivante.

III.3.Caractérisation du mucilage de la racine de pomme de terre et