Implication de la PDE2 dans la régulation de la fonction cardiaque

La particularité de l’activation de la PDE2 par le GMPc pour augmenter l’hydrolyse de l’AMPc permet à la PDE2 de jouer un rôle de rétrocontrôle négatif crucial. Elle permet une interaction entre les voies de signalisation de l’AMPc et du GMPc (Lugnier, 2006) et la compartimentation de ces voies de signalisation.

Au niveau cardiaque, plusieurs études ont reporté une expression tissulaire et myocytaire de la PDE2. Bien que son activité soit relativement faible comparée aux autres PDEs cardiaques, sa présence au niveau de la membrane plasmique contribue à réguler l’activité des LTCCs lorsque les taux de GMPc sont augmentés, dans de nombreuses espèces dont l’Homme (Fischmeister et al., 2005). Ceci a été démontré pour la première fois dans des cardiomyocytes ventriculaires de grenouille dialysés avec de l’AMPc et du GMPc, dans lesquels la PDE2 était capable de diminuer le courant calcique ICa,L, du à son activité d’hydrolyse de l’AMPc, stimulée par le GMPc (Fischmeister & Hartzell, 1987; Hartzell & Fischmeister, 1986). L’utilisation d’EHNA comme inhibiteur de la PDE2 a permis de confirmer ces résultats. En effet, l’EHNA reverse les effets inhibiteurs d’une administration de fortes concentrations de GMPc ou de donneurs de NO sur le courant ICa,L dans les cardiomyocytes ventriculaires de grenouille (Dittrich et al., 2001; Méry et al., 1995) et les cellules atriales humaines (Kirstein et al., 1995; Vandecasteele et al., 2001b). L’administration d’EHNA seule, stimule le courant ICa,L basal (Rivet-Bastide et al., 1997b).

En plus de la régulation de la concentration subsarcolemmale en AMPc, la PDE2 régule à elle seule les taux de GMPc dans ce compartiment. En effet, une étude récente utilisant les canaux CNG a permis de montrer que la PDE2 contrôlait à elle seule les pools particulaires de GMPc, générés par la stimulation de la pGC, mais régulait également (avec la PDE5) les pools de GMPc solubles, générés par la sGC (Castro et al., 2006). Cette étude démontre l’importance de la PDE2 dans la compartimentation des signaux GMPc.

La PDE2 semble gagner de l’importance dans les pathologies cardiaques, caractérisées par une dérégulation neurohormonale. En effet, quelques études ont montré une augmentation de l’activité de la PDE2 dans des modèles d’hypertrophie cardiaque induites chez le rat (Mokni et al., 2010a; Yanaka et al., 2003) et une étude biochimique récente montre une augmentation de son expression dans des tissus de patients atteints de cardiomyopathie dilatée (Aye et al., 2012). Par ailleurs, Mongillo et al. ont montré que la PDE2, en diminuant les taux d’AMPc,

atténuait significativement les effets d’une stimulation β-adrénergique dans les cardiomyocytes de rats néonataux, par un mécanisme PKG/GMPc dépendant, en aval des β3-ARs (Mongillo et al., 2006). D’autre part, une autre étude montre une augmentation de l’effet inhibiteur des β3- ARs sur le courant ICa,L dans des cardiomyocytes ventriculaires isolés de rat IC par un mécanisme faisant partiellement intervenir la voie NOS (Zhang et al., 2005b).

À la lumière de ces données, il est tentant de spéculer que la PDE2 pourrait contribuer à un mécanisme compensatoire pour contrôler la stimulation chronique des β1-ARs et β2-ARs dans les cœurs défaillants par une voie alternative : β3-ARs/NO/GMPc/PKG/PDE2.

Objectifs

Ce qu’il faut retenir de l’étude bibliographique détaillée qui précède est que l’IC est caractérisée par une perturbation de la signalisation de l’AMPc, notamment à cause d’une activation chronique de la voie adrénergique aboutissant à une désensibilisation des récepteurs β-adrénergiques. Les traitements qui augmentent l’AMPc comme la milrinone améliorent les performances cardiaques à court terme mais augmentent la mortalité, à cause d’une surcharge calcique conduisant à des arythmies et à la mort subite. A l’inverse, les β-bloquants, qui réduisent l’action des catécholamines sur la synthèse d’AMPc, réduisent la mortalité, mais ne sont efficaces que dans 40-50% des patients souffrant d'IC, et sont incapables d’améliorer les capacités à l'exercice qui contribuent à une réduction de la qualité de vie.

D’autre part, il y a quelques évidences montrant que l’augmentation de GMPc dans l’IC est bénéfique pour la fonction cardiaque, en partie en contrecarrant l’hyperstimulation de la voie de l’AMPc.

Nous savons enfin que parmi les phosphodiestérases, enzymes régulant le taux d’AMPc et de GMPc dans le cœur, la PDE2 est la seule à être activée par le GMPc pour hydrolyser plus d’AMPc, suggérant son rôle potentiel dans cette altération des voies de signalisation des nucléotides cycliques dans la pathologie cardiaque.

Le premier objectif de ma thèse était d’évaluer le rôle de la PDE2 dans la physiopathologie cardiaque. Pour cela en collaboration avec le laboratoire d’Ali El-Armouche à Göttingen (Allemagne), nous avons déterminé dans un premier temps, à l’aide de techniques de biochimie, l’altération de la PDE2 dans la pathologie cardiaque en comparant son expression et son activité dans des tissus ventriculaires de patients atteints d’IC et dans des modèles animaux d’IC par rapport à des tissus sains.

Nous avons ensuite étudié le rôle de la PDE2 dans l’altération de la voie de l’AMPc par des techniques de physiologie. En effet, nous avons évalué en temps réel, dans des cardiomyocytes isolés de rats avec un stress cardiaque, les signaux AMPc cytoplasmiques grâce à des sondes fluorescentes basées sur la technique d’imagerie de Transfert d’Energie de Fluorescence par Résonance (FRET). Nous avons également étudié dans ces cellules, le rôle de la PDE2 sur le couplage excitation-contraction en mesurant le raccourcissement des sarcomères et les transitoires calciques, grâce à une sonde calcique, à l’aide du système Ionoptix.

Le deuxième objectif de ma thèse était de tester l’hypothèse que l’activation de la PDE2 est bénéfique pour la fonction cardiaque. Pour cela, nous avons surexprimé la PDE2 dans des cardiomyocytes de rats, à l’aide d’un adénovirus codant pour cette enzyme. Nous avons évalué le rôle de la surexpression de la PDE2 sur la signalisation AMPc globale et le couplage excitation-contraction par les techniques de physiologie évoquées plus haut et la technique de patch-clamp. Nous avons également étudié le rôle de cette surexpression sur l’hypertrophie cellulaire et sur les arythmies, induites par une stimulation chronique de la voie adrénergique, évaluées en mesurant la surface cellulaire par planimétrie ou en comptant le nombre d’événements spontanés, respectivement.

Afin de valider l’hypothèse que l’activation de la PDE2 est cardioprotectrice, une série d’animaux transgéniques (TG) surexprimant la PDE2A spécifiquement dans le cœur (sous le contrôle du promoteur αMHC) a été générée en collaboration avec le laboratoire d’Ali El- Armouche. Nous avons validé le modèle en vérifiant la surexpression du transcrit en qRT-PCR, de la protéine en Western blot et l’augmentation de l’activité enzymatique en dosage d’activité des PDEs. Parallèlement à ce projet, une stratégie de criblage de molécules visant à identifier des petites molécules activatrices de PDE2 a été menée sur la plate-forme de criblage CIBLOT (IFR141, Châtenay-Malabry). Pour ce faire, nous avons purifié la protéine PDE2 à partir de glandes surrénales de bœuf, tissu dans lequel la PDE2 est majoritaire, puis à l’aide des ingénieurs de CIBLOT, nous avons mis-au point un test d’activité adaptable à la mesure à haut débit. Le but final étant de tester si des activateurs chimiques de la PDE2 pourraient empêcher ou retarder le développement de l’hypertrophie, ou le passage de l’hypertrophie vers l’insuffisance cardiaque.

Matériel et Méthodes

Je décrirai dans cette section uniquement les méthodes que j’ai utilisées ou développées. Celles utilisées dans les collaborations sont décrites dans les articles (Partie Résultats).