Implication majeure d’AKT et p38-MAPK mais pas deERK1/2 dans la dégranulation de

Pour étudier la contribution d’AKT, de p38-MAPK et ERK1/2 dans la libération de la MPO des PN, une approche pharmacologique a été choisie basée sur l’inhibition des effecteurs à l’aide d’antagonistes sélectifs dans des PN de donneurs sains.

L’inhibition des effecteurs de signalisation a été vérifiée par immuno-empreinte à l’aide d’anticorps spécifiques pour les formes phosphorylées de ces effecteurs. Ainsi, le prétraitement des PN avec des concentrations d’AKTib1/2 (1-10 µM)qui inhibent complètement la phosphorylation d’AKT induite par le fMLP (Figure 5A et B), réduit la dégranulation nette induite par le fMLP d’environ 40 à 50% (Figure 5C), sans altérer la dégranulation basale ni l’activité de la MPO (Figure 5D). Pareillement, le blocage de la phosphorylation de p38-MAPK (Figure 6A et B) par le SB202190 (1-10 µM) inhibe de 50% la dégranulation des PN normaux stimulés avec du fMLP (Figure 6C), sans affecter la dégranulation basale ni l’activité de la MPO (Figure 6D).

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Figure 5. AKT est un effecteur majeur dans la dégranulation de la MPO dans les PN. (A-B) Les PN de

donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en présence de l’antagoniste d’AKT, l’AKTib1/2 (0-10µM), puis stimulés avec du fMLP (1µM/2min). La phosphorylation d’AKT(S473) a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs contrôles obtenues avec le fMLP (n= 4;

*p <0.05). (C) Les PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en

présence d’AKTib1/2 (0-10µM), puis avec de la cytochalasine B pendant 5 min. Les cellules ont été ensuite stimulées avec du fMLP (1µM/2min), la libération de la MPO a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle fMLP (n=6; *p<0.05). (D) Le surnageant de dégranulation obtenu avec le fMLP a été incubé en présence d’AKTib1/2(10µM) pendant 20 min puis l’activité de la MPO a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle.

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Figure 6. La p38-MAPKinase est un effecteur majeur dans la dégranulation de la MPO dans les PN. (A-B) Les

PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en présence de l’antagoniste de p38-MAPK, le SB202190 (0-10 µM), puis stimulés avec du fMLP (1 µM/2 min). La phosphorylation de p38-MAPK a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs Contrôle obtenues avec le fMLP (n= 4; *p <0.05). (C) Les PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en présence de SB202190 (0-10µM), puis avec de la cytochalasine B pendant 5 main. Les cellules ont été ensuite stimulées avec du fMLP (1 µM/2 min), la libération de la MPO est quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle fMLP (n=6; *p<0.05). (D) Le surnageant de dégranulation obtenu avec le fMLP a été incubé en présence le SB202190 (10µM) pendant 20min puis l’activité de la MPO est quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle.

Ces résultats montrent que AKT et p38-MAPK sont des effecteurs majeurs dans la transduction du signal de dégranulation dans les PN activés avec du fMLP. Cependant, AKTib1/2 et SB202190 réduisent la dégranulation des PN avec la même efficacité (près de 50%) (Valeurs d'IC50 dans le Tableau 7), suggérant la possibilité que les deux effecteurs AKT et p38-MAPK interviennent dans la même voie de signalisation.

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Ceci nous a incité à examiner si p38-MAPK serait activée en aval d’AKT. Pour cela, les PN ont été traités avec AKTib1/2 (3µM), ce qui réduit de 50% la phosphorylation de p38-MAPK induite par le fMLP (Figure 7A et B). Cependant, cette réduction est observée sur la phosphorylation mesurée après une minute de stimulation des PN, mais pas pour des temps plus courts (30sec).Ces résultats indiquent que la p38-MAPK est activée via deux processus, l’un est inhibable par AKTib1/2 confirmant ainsi notre hypothèse que p38-MAPK serait activée en aval d’AKT, et l’autre indépendant d’AKT.

Figure 7. La p38-MAPKinase est activée en aval d’AKT dans la cascade de signalisation induite par le fMLP dans le neutrophile. (A-B) Les PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence

(contrôle) ou en présence de l’antagoniste d’AKT, l’AKTib1/2 (0-10µM), puis stimulés avec du fMLP (1 µM/2 min). La phosphorylation d’AKT(S473) et de la p38-MAP Kinase a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs contrôles obtenues avec le fMLP (n= 4; *p <0.05).

Tableau 7. Valeurs d'IC50 des différents inhibiteurs sur la dégranulation et l’activation des effecteurs majeurs

de la signalisation.

Inhibiteur Dégranulation* AKT p38-MAPK ERK1/2

Aktib1/2 3-5 µM 2-3 µM 2-3 µM -

SB202190 3-5 µM - 3-5 µM -

U0126 - - - 2-3 µM

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Figure 8. L’antagoniste de ERK1/2, U0126, interfère avec l’activité de la MPO dans le surnageant de dégranulation. (A-B) Les PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou

en présence de l’antagoniste de p44/42-MAPK (ERK1/2), l’U0126 (0-10 µM), puis stimulés avec du fMLP (1 µM/2 min). La phosphorylation de p44/42-MAPK a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs contrôles obtenues avec le fMLP (n= 4; *p <0.05). (C) Les PN de donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en présence de U0126 (0-10µM), puis avec de la cytochalasine B pendant 5 main. Les cellules ont été ensuite stimulées avec du fMLP (1µM/2min), la libération de la MPO est quantifié et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle fMLP (n=6; *p<0.05). (D) Le surnageant de dégranulation obtenu avec le fMLP est incubé en présence le U0126 (10µM) pendant 20min puis l’activité de la MPO est quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle.

Concernant, la voie des p44/42MAPK, l’inhibition complète de l’activation de ERK1/2 par son antagoniste U0126 (Figure 8A et B) est également associée à une très forte inhibition de la dégranulation de la MPO des PN stimulés avec du fMLP (Figure 8C). Cette inhibition quasi- complète nous est apparue suspecte suggérant un possible artefact technique. En fait, elle s’est avérée être due à une interférence de l’U0126 avec l’activité de la MPO comme le montre la forte inhibition de l’activité de la MPO d’un surnageant de dégranulation qui avait été prétraité avec l’antagoniste UO126 (Figure 8D). Pour pallier à cette contrainte technique, nous avons choisi de mesurer un autre marqueur de dégranulation, l’activité de l’élastase qui est localisée dans les mêmes granules azurophiles que la MPO.

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Figure 9. ERK1/2 ne serait pas impliquée dans la dégranulation des PN stimulés par le fMLP. (A) Les PN de

donneurs sains ont été prétraités pendant 20min en absence (contrôle) ou en présence de U0126 (0-10 µM), puis avec de la cytochalasine B pendant 5 min. Les cellules ont été ensuite stimulées avec du fMLP (1 µM/2 min), la libération de l’élastase a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle fMLP (n=6; *p<0.05). (B) Le surnageant de dégranulation obtenu avec le fMLP est incubé en présence le U0126 (10 µM) pendant 20 min puis l’activité élastase a été quantifiée et exprimée en pourcent des valeurs du contrôle.

L’inhibition de ERK1/2 par U0126 dans les PN ne montre aucun effet ni sur la libération de l’élastase induite par du fMLP (Figure 9A), ni sur l’activité élastasique dans le surnageant (Figure 9B). Cependant, l’U0126 est bien actif car il inhibe partiellement (35%) la génération du superoxyde induite par le fMLP (Figure 9A). Ces résultats suggèrent ainsi que ERK1/2 ne seraient pas significativement impliquées dans les mécanismes de dégranulation des PN induite par le fMLP. Cependant, ERK1/2 contribuerait partiellement dans la signalisation impliquée dans la réponse oxydative des PN, ce qui est en accord avec d’autres travaux antérieurs (Djerdjouri et

coll., 1999 ; Paruch et coll., 2006 ; Patel et coll., 2010).

IV.5. L’agoniste des récepteurs Toll 7/8 (TLR7/8), le CL097, potentialise la dégranulation