CHAPITRE 7 DISCUSSION GÉNÉRALE
7.2 Impact des stratégies sur le rendement des cultures
La flexibilité qu’offre le système inductible du point de vue opérationnel nous a permis de porter un regard distinct sur les conditions de culture de chaque phase, dans le but d’amener les cellules dans un état optimal de croissance ou de production.
Dans un premier temps, nous avons montré les améliorations encourues par l’emploi d’un mode cuvée-alimentée avec ajustement dynamique du taux d’alimentation tout au long de la culture, soit dans les phases de croissance et de production. Les résultats de nos travaux ont montré que ce mode de culture conduit à une augmentation de la productivité spécifique et de la production volumétrique par rapport au mode cuvée. Bien que l’expression de l’anticorps survienne essentiellement lors de la phase post-induction, nous avons démontré l’importance de supplémenter les cultures dès le début de la phase de croissance pour réduire les risques de limitations nutritionnelles pouvant nuire au rendement final. Nous avons également mis en lumière l’importance du taux d’alimentation dans ce type de culture. Les besoins cellulaires en début de culture sont généralement faibles et la supplémentation en nutriments peut conduire à l’accumulation de métabolites non-désirables (Ma et al., 2009). Notamment, de hautes concentrations en glucose dans le milieu de culture sont généralement caractérisées par un taux de consommation élevé, suivi d’une oxydation incomplète laissant place à une production importante de lactate, même en présence de suffisamment d’oxygène (Gowtham et al., 2017). De ce fait, ajuster la quantité de nutriments à ajouter à la culture est déterminant pour éviter, d’une part, le risque de suralimentation des cellules, et d’autre part, de sur-concentrer certains nutriments secondaires qui peuvent devenir inhibiteurs à de hauts niveaux. Nous avons démontré au cours de cette étude l’effet néfaste d’un régime d’alimentation trop agressif sur la croissance et le rendement des cultures. Néanmoins, les cultures induites à haute densité cellulaire présentaient une production spécifique significativement réduite même en mode cuvée-alimentée. Du point de vue métabolique, et en dépit de la disponibilité du glucose dans le milieu extracellulaire, le taux de consommation lors des 48h précédant l’induction demeure relativement faible pour la culture induite à haute densité cellulaire par rapport aux autres conditions d’induction. Cela peut laisser suggérer un état cellulaire moins actif et une moindre production d’énergie.
Notons que la majorité des études rapportent l’effet bénéfique du changement d’état métabolique du lactate vers sa consommation sur la productivité spécifique (Le et al., 2012; Templeton et al., 2013). Dans notre cas, le changement partiel du lactate est suivi d’une accumulation jusqu’à la fin des cultures et ce pour pratiquement toutes les conditions testées. Par ailleurs, cette corrélation peut être dépendante de la lignée cellulaire utilisée (Honda, Lenas, Watanabe, Kitade, & Kobayashi, 1998; Kurokawa et al., 1994).
D’autres stratégies de culture ont alors été envisagées afin de promouvoir l’induction à haute densité cellulaire et d’améliorer les rendements. En effet, des cultures réalisées avec un changement
(partiel ou total) du milieu de culture au moment de l’induction ont montré une augmentation de la concentration cellulaire et de la productivité, tant en modes cuvée que cuvée-alimentée. Outre un apport en nutriments, ce changement de milieu a pour effet de diluer la concentration en métabolites susceptibles d’inhiber les cultures. Ceci nous a amenés à considérer le recours à un mode perfusion, mais uniquement pendant la phase de croissance afin d’éviter de diluer le produit d’intérêt. Un mode cuvée-alimentée était cependant utilisé lors de la phase de production. Enfin, plutôt que de choisir entre cultiver les cellules en mode cuvée-alimentée ou perfusion, nous avons également tenté d’exploiter les avantages que peuvent offrir ces deux procédés combinés (Jeng‐Dar Yang et al., 2000). La stratégie de culture perfusion-alimentée a montré une augmentation considérable de l’intégrale de cellules viables comparée aux cultures cuvée-alimentée et perfusion. Les rendements ont augmenté de façon appréciable dans les cultures en flacons, mais sont restées relativement similaires en bioréacteur pour les différents modes. Néanmoins, le mode perfusion-alimentée permet d’atteindre des concentrations proches du maximum en un temps plus court, ce qui peut conférer un avantage en termes de productivité pour un temps de récolte plus court.
Maintenir une bonne viabilité cellulaire sur de longues périodes est souvent souhaitable pour assurer des rendements de production élevés (S Oguchi et al., 2003). L’une des approches les plus employées est la réduction de la température visant à ralentir ou à arrêter la croissance et prolonger ainsi la phase de production. Les effets de la température sur la croissance et sur le cycle cellulaire ont été largement documentés dans le cas des lignées CHO stables (Kumar et al., 2007). Notre étude comparative des cinétiques de croissance et de production a démontré que des conditions légèrement hypothermiques pendant la phase de production permettent d’améliorer significativement les rendements en produit, tant à basse qu’à haute densité cellulaire à l’induction. Cependant, faire croitre les cellules à 34 oC dans la phase pré-induction pour minimiser la variation de température au moment de l’induction n’a pas donné lieu à de bonnes performances, en flacons comme en bioréacteur.
En examinant les rendements obtenus dans toutes les cultures effectuées dans le cadre de cette thèse, on constate que la meilleure production (1.8 g/L) correspond à un bioréacteur opéré en mode cuvée-alimentée à des températures de 37-30 oC. La culture en mode perfusion-alimentée, opérée pour sa part à 37-34 oC, a conduit à des titres maximums plus faibles (1.5 g/L en flacons, 1.2 g/L en bioréacteur), mais présente la productivité volumétrique la plus intéressante si on considère une récolte effectuée plus tôt (dont l’avantage est discuté dans la section suivante). Une perfusion- alimentée opérée à 37-30 oC n’a toutefois pas été effectuée.