Impact des altérations de PAX5 sur la différenciation B

La modélisation des altérations de PAX5 dans des systèmes ex vivo ou in vivo permettrait de décrypter leur implication dans la leucémogenèse B. Ces altérations affectent tous les domaines de PAX5 suggérant des mécanismes d’action différents. Pour les mutations ponctuelles, on distingue le mutant P80R dont le domaine de liaison à l’ADN est altéré et le mutant G336 dont le domaine de transactivation est muté. Les translocations quant à elles conservent les 5 premiers exons de PAX5 juxtaposés à ELN ou ETV6. Enfin le mutant de délétion partielle a perdu le cas présent, les exons 2 à 6 c'est-à-dire le domaine de liaison à l’ADN et l’octapeptide.

En présence d’IL-7, les cellules infectées par le mutant P80R acquièrent le marqueur Igκ et perdent le marqueur BP1. Il semble pousser la différenciation B. Ce résultat suggère que la modification du domaine de liaison à l’ADN bipartite pourrait permettre la fixation de PAX5 muté sur des cibles qui ne peuvent pas être activées en présence d’IL-7. La nature bipartite du domaine paired permet une spécificité plus variée des sites de liaisons (Czerny et al., 1993). La mutation pourrait changer l’affinité du domaine à l’ADN, entrainant une fixation sur un large éventail de cibles de PAX5 sauvage, en présence d’IL-7. De plus, on constate une augmentation de la prolifération (comptage des cellules en culture). En plus de la voie de signalisation IL-7 récepteur dépendante, le mutant du fait de sa modification pourrait agir sur

128 des cibles intervenant dans le cycle cellulaire. La validation de ces hypothèses nécessite des analyses complémentaires afin de déterminer les cibles spécifiques de ce mutant par rapport au PAX5 sauvage. De plus, P80R semble être insensible à l’IL-7 et semble forcer l’expression d’Igκ à la surface des cellules (normalement indétectable à ce stade).

En absence d’IL-7, on constate des variations de comportement du contrôle PAX5 wt ainsi que des mutants. Nos contrôles négatifs MIE (vecteur rétroviral vide) et le mutant de délétion partielle (délétion des exons 2 à 6 de PAX5), ne bloquent pas la différenciation, les cellules acquièrent Igκ et perdent BP1. Ce contrôle a permis de montrer que le blocage dû aux mutants n’était pas lié à l’expression d’une protéine dans les cellules pro-B.

Nous voulions utiliser le PAX5 wt comme contrôle de différenciation. Or étonnamment, ce contrôle bloque la différenciation des cellules B, elles conservent le marqueur BP1 sans acquérir le marqueur Igκ. L’expression rétrovirale de PAX5 dans les cellules B possède un niveau d’expression supérieur au PAX5 endogène. Ceci pourrait être à l’origine du blocage de différenciation observé en absence d’IL-7. PAX5 contrôle finement l’expression de gènes permettant la progression des cellules B dans la différenciation lymphoïde. Parmi ces cibles, PAX5 régule l’expression du pré-BCR. Le pré-BCR est essentiel pour le développement normal des cellules B et une modification d’expression conduirait à la mise en place de processus oncogéniques. La signalisation en aval conduit au passage pro-B/pré-B, l’exclusion allélique de l’isotype µ de la chaine lourde et la sous expression de la machinerie de recombinaison, de la prolifération et de la transcription des composants VpréB et λ5 de la

pseudo-chaine légère (Martensson et al., 2010). PAX5 active des gènes cibles des composants essentiels des voies de signalisation des pré-BCR comme la chaine mb-1 de transduction du signal (appelé aussi Cd79a) (Fitzsimmons et al., 1996; Nutt et al., 1997), les récepteurs stimulateurs Cd19 et Cd21 (Horcher et al., 2001; Kozmik et al., 1992; Nutt et al., 1998), le récepteur inhibiteur Cd72 (Horcher et al., 2001; Ying et al., 1998) et l’adaptateur central Blnk (aussi appelé SLP65) (Schebesta et al., 2002). Une modification d’expression de ces gènes par PAX5 aussi minime soit elle, aurait alors un effet sur le point de contrôle du pré-BCR en empêchant les cellules de passer au stade de différenciation suivant et conduirait à une augmentation de la mort cellulaire. Chaque molécule de pré-BCR est produite de manière stœchiométrique, la surexpression de certaines molécules comme CD79a pourrait-il avoir un effet seul sans être couplé au récepteur, menant alors à un défaut dans sa signalisation et

129 bloquant de ce fait le développement normal des cellules B. PAX5 pourrait avoir un effet sur cet équilibre.

En absence d’IL-7, les translocations et les mutants ponctuels bloquent la différenciation en conservant le marqueur BP1 et n’acquièrent pas Igκ. Les translocations PAX5-X et le P80R se maintiennent en pré-B en gardant l’expression du marqueur BP1. Ces mutants conservent le signal de localisation nucléaire, donc ils entrent en compétition avec la molécule sauvage de PAX5. Ces résultats suggèrent que ces mutants agissent sur les cibles de PAX5, modulant leur expression, ils empêchent le passage des cellules au stade suivant de la différenciation B. Le mutant ponctuel G336 quant à lui semble entrainer la mise en place d’un processus de dédifférenciation, parce que les cellules perdent le marqueur BP1 mais n’acquièrent pas Igκ. Ce mutant conserve le domaine de liaison à l’ADN de PAX5 mais perd les domaines trans- activateur et inhibiteur, la conséquence la plus probable serait qu’une fois fixé sur les cibles de PAX5, le G336 conduirait à un arrêt avant l'acquisition d’Igκ ou à une reprogrammation des cellules B.

Les différents mutants de PAX5 ne sont pas équivalents en fonction, ils ne semblent pas avoir les mêmes impacts sur la différenciation B. Comme le mutant de délétion partiel n’a aucun effet sur la différenciation B, la présence du domaine de liaison à l’ADN semble essentiel dans la mise en place d’un processus oncogénique. Le système étudié ne nous permet pas d’évaluer de manière optimale les conditions pathologiques du fait de la présence de deux copies du gène PAX5 sauvage mais nous aiguille vers des pistes de travail à creuser par la suite.