Des marquages immunohistologiques/immunohistochimiques ont été effectués sur des ME ouvertes ou sur des coupes frontales. Pour cela, la ME entière, prélevée de l’embryon puis ouverte ou non le long du sillon dorsal, est fixée pendant 2 heures à température ambiante avec du ParaFormAldéhyde (PFA) 4% puis rincée trois fois avec du PBS 0,1M. Pour les marquages immunohistochimiques réalisés sur ME, l’incubation des anticorps primaires peut se faire après ce rinçage. Pour les coupes frontales, les ME non ouvertes sont cryoprotégées par des bains successifs de sucrose 15% puis 30% à 4°C pendant 24h pour chaque étape. La partie lombaire, reconnaissable par ses renflements, est isolée et incluse dans une capsule de gélatine (Gelatin capsule, size 000, ref 70101, Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA) contenant une résine (OCT Compound ref 4583, Sakura Finetek, Alphen aus dem Rijn, Pays-Bas) qui durcit au contact de l’isopentane refroidi à l’azote liquide (-196°C). Des coupes frontales de 25 µm d’épaisseur sont ensuite réalisées à l’aide d’un cryostat (CM3050 S, Leica Microsystem, Nanterre, France) et déposées sur des lames gélatinées. Pour le gélatinage, les lames sont immergées 10 minutes dans une solution de gélatine 2% et d’alun de chrome 0,1%, égouttées et séchées pendant 48h dans une étuve à 40°C. Une fois déposées sur les lames, les coupes frontales sont séchées à température ambiante pendant quelques heures puis conservées au congélateur (-20°C) en attendant la réalisation des immunomarquages. Pour cette dernière étape, les coupes frontales de ME sont réhydratées dans du PBS 0,1M pendant 20 minutes à température ambiante avant le début de l’expérience.
La ME entière (ouverte) ou les lames contenant les coupes frontales sont alors incubées pendant 48 heures à 4°C avec un anticorps primaire dilué dans une solution de PBS
0,1M avec 2% de BSA (Bovine Serum Albumin) et 0,5% de Triton X-100. Les ME ou les coupes sont ensuite rincées avec du PBS (3 fois 5 minutes) puis incubées pendant 2 heures à température ambiante à l’abri de la lumière avec une solution d’anticorps secondaire fluorescent approprié. Après 3 rinçages de 5 minutes, les ME ou les coupes sont montées entre lame et lamelle avec du milieu de montage Fluoromount G (FP-483331, Interchim). Après polymérisation du milieu de montage, les marquages peuvent être observés au microscope confocal.
La liste et la provenance des anticorps primaires sont indiquées dans la table 2. Les anticorps secondaires fluorescents proviennent de chez Molecular Probes Ils sont produits chez la chèvre et sont couplés avec des sondes fluorescentes Alexa 488 (FITC, vert), Alexa 546 (TRITC, rouge) et Alexa 647 (Cy5, rouge lointain, couleur restituée bleue).
Pour les marquages de KCC2 sur la membrane, nous avons utilisé une lignée de souris Hb9-eGFP-SOD1G93A afin de travailler sur des MNs identifiés (GFP) SOD1G93A ou WT de la même portée. Ceci nous a permis de localiser le co-transporteur KCC2 situé au niveau de la membrane cytoplasmique du corps cellulaire du MN.
Anticorps primaire,
Fournisseur Dilution
Anticorps
secondaire Cible étudiée
FoxP1, Millipore 1/500 anti-lapin MNs colonne latérale (marquage nucléaire)
GABA, A2052, Sigma Aldrich 1/200 anti-lapin INs GABA
Glycine, IG1001, ImmunoSolution, Jesmond New South Wales, Australia
1/3000 anti-rat INs Glycine
Islet 1a, 39.4D5, DSH Bank,
Iowa 1/100 anti-souris MNs (marquage nucléaire)
Islet 2b, 40.2D6, DSH Bank,
Iowa 1/100 anti-souris MNs (marquage nucléaire)
KCC2, Upstate, Millipore 1/400 anti-lapin Cotransporteurs KCC2 NeuN, MAB377, Millipore 1/500 anti-souris Neurones (marquage nucléaire)
NKCC1-phosphorylé, Biff
Forbush 1/3000 anti-lapin
Forme phosphorylée du cotransporteur NKCC1
5-HT, Tramu 1/5000 anti-lapin Fibres
Table 2 : Liste des anticorps utilisés en marquages immunohistochimiques. Les anticorps primaires sont dilués dans du PBS contenant du Triton (1%), de la BSA (2%). L’incubation est réalisée à 4°C en chambre humide pendant 48h. Les anticorps secondaires sont dilués à différentes concentrations selon l’anticorps utilisé dans du PBS et incubés pendant 2h à température ambiante, en chambre humide et à l’obscurité. INs = interneurones, MNs = motoneurones.
2. Acquisition des images en microscopie confocale
Les observations ont été réalisées avec un microscope confocal BX51 Olympus Fluoview équipé d’un laser argon (émission à 488 nm, marquage FITC Alexa 488), d’un laser hélium néon vert (émission à 543 nm, marquage TRITC Alexa 546) et d’un laser hélium néon rouge (émission à 633 nm, marquage Cy5 Alexa 647). Des coupes optiques sériées ont été réalisées avec des épaisseurs différentes en fonction de l’objectif utilisé : 1,2 µm à l’objectif x10 ; 0,6 µm au x20 ; 0,3 µm au x40 et au x60.
Pour les observations FoxP1 et KCC2 sur la membrane, nous avons utilisé un microscope confocal Leica SP5 situé au BIC (Bordeaux Imaging Center) donc le principe est le même que pour le microscope précédent excepté l’objectif x60 qui est remplacé par un
Figure 14 : Schéma du principe du confocal. Un laser envoie des rayons lumineux (flèches bleues) de longueur d’onde donnée sur tout le tissu. Cette lumière est sélectionnée par un filtre d’émission selon la longueur d’onde utilisée. En réponse, les fluorochromes fluorescents (flèches multicolores) vont être excités en un point de l’échantillon. Un photomultiplicateur permet d’amplifier les rayons émis par un point focal précis du tissu.
3. Analyse des images et quantifications
L’analyse des images est réalisée avec le logiciel ImageJ (Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA). Pour les quantifications du co-transporteur NCCC1 phosphorylé, du GABA et de la Glycine, des acquisitions sont réalisées à l’objectif x40. L’intensité moyenne des pixels est mesurée sur une projection de 4 coupes dans la zone dorsale, ventrale ou au niveau du canal central selon les conditions, et le bruit de fond moyen est déduit de cette valeur.
Pour les quantifications du co-transporteur KCC2, des acquisitions sont réalisées à l’objectif x63. L’intensité moyenne des pixels est mesurée sur une coupe dont l’acquisition a été réalisée au niveau ventral et le bruit de fond moyen est déduit de cette valeur. Pour la quantification du co-transporteur KCC2 au niveau de la membrane cytoplasmique (zone du corps cellulaire) du MN, une macro sous ImageJ a été développée par M. Sébastien MARAIS au BIC. Cette macro permet de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence dans une zone comprenant la bordure du MN (aux alentours de la membrane cytoplasmique) et 5 pixels à l’intérieur et 5 pixels à l’extérieur de cette bordure.