Activité locomotrice induite par la 5-HT

Nous avons tout d’abord réalisé des expériences de locomotion fictive induite par la bioamine 5-HT seule (5 µM) afin d’activer les générateurs de la locomotion dans des conditions minimales permettant de mettre en défaut le système. Puis dans un second temps nous avons utilisé un cocktail composé de 5-HT (10 µM), NMDA (10 µM) et DA (100 µM) pour évoquer in vitro une activité locomotrice-like plus robuste.

Pour étudier cette activité, des enregistrements extracellulaires des racines lombaires L3 droite et L3 gauche ont été réalisés. L’activité locomotrice-like est définie par deux critères : le rythme et le patron. La génération du rythme est dépendante de neurones excitateurs glutamatergiques et la génération du patron implique des circuits neuronaux excitateurs et inhibiteurs contrôlant l’alternance droite/gauche.

L’alternance des activités électriques produites par les racines L3 droite et gauche (L3d-L3g) (Figure 33A1 et 33B1) a été analysée à l’aide d’un script développé au laboratoire par M. Daniel CATTAERT sous le logiciel Spike 2. Ce script effectue, dans un premier temps, une identification des PAs enregistrés sur les racines L3d et L3g grâce à un seuillage

automatique. Puis les fréquences instantanées de ces PAs sont calculées au cours du temps. Un filtre passe-bas flottant permet de lisser ces activités sans décalage temporel (Figure 33A3 et 33B3) et de repérer les pics d’activités au sein de chaque bouffée (Figure 33A4 et 33B4). Enfin la relation de phase moyenne entre les activités L3d et L3g est calculée par une méthode de statistiques circulaires (Figure 33A5 et 33B5).

Pour chaque moelle épinière, des critères de locomotion ont été déterminés à partir de 1) la distribution des valeurs de relation de phase (R), donnant une indication sur le patron et 2) du coefficient de variation des périodes (CVper) entre chaque burst donnant une indication sur la stabilité du rythme d’autre part. Les CVper présentent une distribution bimodale (Figure 32A) qui nous a permis de séparer les rythmes stables (CVper < 0,3) des rythmes instables (CVper > 0,3). De même, l’histogramme de distribution des valeurs de relation de phase R (Figure 32B) nous a permis d’identifier des activités de type locomotion stable (R > 0,5), locomotion instable (0,3 < R < 0,5) et absence de locomotion (R < 0,3). En résumé, on parlera de locomotion fictive stable lorsque le rythme est stable c'est-à-dire que le coefficient de variation des périodes est inférieur à 0,3 et lorsque la relation de phase (R) supérieure à 0,5. Au sein du rythme instable, on retrouve : 1) la locomotion fictive instable définie par un coefficient de variation des périodes supérieur à 0,3 et une valeur de R comprise entre 0,3 et 0,5 et 2) l’absence de locomotion fictive lorsque le coefficient de variation des périodes est supérieur à 0,3 et la valeur de R est inférieure à 0,3 (Figure 32).

Figure 32 : Critères de caractérisation de la locomotion fictive. (A) Les coefficients de variation des périodes (CVper) présentent une distribution bimodale permettant de séparer les rythmes stables (CVper < 0,3) des rythmes instables (CVper > 0,3). (B) L’histogramme de distributions des valeurs de R nous permet la locomotion stable (R > 0,5), la locomotion instable (0,3 < R < 0,5) et l’absence de locomotion (R < 0,3).

D’après ces critères, lors de l’application de 5-HT, nous pouvons constater que les ME WT sont capables de produire des activités locomotrices-like dans 54% des cas (n=8) (Figure 33C). Cette locomotion est, dans 27% des cas, une locomotion dite stable (n=4) et dans 27% des cas, une locomotion dite instable (n=4). Les ME E17,5 SOD1^G93A sont capables, dans 40% des cas (n=4), d’exprimer une activité locomotrice-like 5-HT-induite de type instable. Aucune ME n’est capable de faire de la locomotion stable (Figure 33C). La locomotion fictive stable n’étant pas présente chez les souris SOD1^G93A, notre analyse de la locomotion fictive ne prendra pas en compte ces données chez les souris WT.

Dans notre analyse, la moyenne des amplitudes de variation des fréquences par cycle est calculée de la manière suivante : moyenne = Σ (fréquence maximale-fréquence minimale)/n où n représente le nombre de bouffée d’activité.

L’analyse de la locomotion fictive induite par l’application de 5-HT révèle que la moyenne des amplitudes de variation de fréquences par cycle est différente entre les

Mann et Whitney) (Figure 35A). Ce résultat peut-être interprété comme un déficit d’inhibition au niveau des MNS SOD1^G93A. Cependant, aucune différence significative n’est observée au niveau de la période entre chaque bouffée entre les embryons WT et SOD1^G93A (3,96 ± 0,29 s et 3,45 ± 0,17 s, respectivement) (p>0,05, Mann et Whitney). De plus, aucune différence significative n’est observée au niveau des coefficients de variation des fréquences et des périodes (p>0,05, Mann et Whitney) (Figure 35A).

En conclusion, ces expériences ayant pour but de tester la capacité des réseaux spinaux à générer des patrons moteurs rythmiques après application de la monoamine 5-HT montrent que les ME E17,5 SOD1^G93A ne sont pas capables de réaliser de la locomotion fictive stable contrairement aux ME WT. Ce résultat est en accord avec nos données collectées à l’échelle cellulaire au niveau des MNs montrant un déficit des inhibitions chlorure-dépendantes observé chez les souris SOD1^G93A.

Figure 33 : Etude de la locomotion fictive induite pharmacologiquement chez les embryons WT (A) et SOD1^G93A par l’application de 5-HT. Les enregistrements sont réalisés en configuration extracellulaire au niveau des racines L3 et la locomotion fictive est induite à l’aide de 5-HT (5µM) (A1-B1). Un script développé sous le logiciel Spike 2 permet de détecter des épisodes d’activité rythmique induite par la 5-HT (A2-B2). Brièvement, la fréquence de décharge de PAs au niveau des racines L3d et L3g est calculée et filtrée afin de détecter les pics d’activité au sein de chaque bouffée d’activité au cours du temps (A4-B4). La relation de phase moyenne est alors calculée par une méthode de statistiques circulaires (A5-B5). Le pourcentage de ME capables d’exprimer des épisodes