3. Le système immunitaire
3.1 Immunité innée
L'immunité innée est déclenchée invariablement lors de toutes infections microbiennes. Elle comprend différents types cellulaires et mécanismes qui agissent de manière non spécifique pour éliminer le microorganisme étranger. Elle est induite lors de la reconnaissance de motifs spécifiques aux pathogènes, aussi nommés PAMPs pour «pathogen-associated molecular patterns», par différents récepteurs cellulaires nommés PRRs («pattern recognition receptors») ou par l'opsonisation des pathogènes.
La base du système immunitaire repose principalement sur la réponse de différents types cellulaires qui originent des cellules pluripotentes de la moelle osseuse: les cellules hématopoïétiques. Ces cellules souches donnent naissance à deux différents types de précurseurs peu différenciés nommés précurseurs lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules de l'immunité innée originant de la branche lymphoïde sont les cellules NK («natural killer»), ainsi que les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Cet embranchement donne aussi naissance aux lymphocytes B et T, principales populations constituant le système adaptatif. La voie myéloïde est responsable de la formation des leucocytes polymorphonucléaires, soient les neutrophiles, les basophiles et les éosinophiles. Ce même précurseur peut aussi donner naissance aux cellules mononuclées telles que les mastocytes, les cellules dendritiques, les monocytes et les macrophages. Les erythrocytes et les plaquettes dérivent aussi du groupe myéloïde [5]. Les sections suivantes traiteront des types cellulaires de l'immunité innée en relation avec l'infection par EBV.
3.1.1. Les neutrophiles
Les neutrophiles constituent le type cellulaire le plus abondant des cellules sanguines et participent aux événements précoces de l'inflammation. Ils sont en effet les premiers à être recrutés par chimiotaxie au site d'infection entre autres par l'IL-8, une chimiokine produite par
les phagocytes ou les cellules endothéliales activées [5]. Leurs implications dans le processus inflammatoire sont diversifiées, pouvant agir comme phagocyte ou alors par la libération de molécules antimicrobiennes lors d'un mécanisme nommé dégranulation. La phagocytose faite par les neutrophiles produit un stress oxydatif qui favorise l'éradication du microorganisme, ce qui a d'ailleurs été observé lors de l'infection par le virus Herpès Simplex (HSV) [68]. Les neutrophiles peuvent aussi relarguer divers médiateurs antimicrobiens et sécréter une gamme variée de cytokines, augmentant ainsi l'efficacité de la réponse immunitaire (revue dans [69, 70]).
Nous avons démontré au laboratoire qu'EBV pouvait modifier le cours normal de la vie d'un neutrophile humain en induisant prématurément le processus apoptotique de ce dernier [71]. Lors de cette même étude, il a de plus été démontré qu'EBV pouvait infecter le neutrophile, et ce, par la visualisation de particules virales au niveau du cytoplasme et du noyau des cellules infectées. Par contre, cette infection ne mène vraisemblablement pas à l'établissement d'une phase lyrique alors qu'aucun transcrit lyrique n'a été détecté. L'induction d'une mort prématurée des neutrophiles par EBV pourrait constituer un avantage pour le virus en affaiblissant l'efficacité de la réponse immune lors des premières heures de l'infection. En plus d'induire l'apoptose, EBV déclenche aussi la synthèse de nouvelles protéines cellulaires et la production de plusieurs cytokines comme l'IL-l-ct, IL-1-0, l'antagoniste du récepteur de IL- 1 (IL-IRa), l'IL-8 ainsi que MlP-la [70, 72, 73]. D'autre part, la biosynthèse du leucotriène B4, un médiateur reconnu pour ses propriétés antivirales [74, 75], est augmentée lors de la stimulation d'une cellule infectée par EBV [76], révélant peut-être un rôle important dans le contrôle de la dissémination d'EBV.
3.1.2. Les monocytes
Les monocytes représentent une sous-population des cellules mononuclées du sang périphérique qui ne forme qu'un faible pourcentage des cellules totales, soit entre 5 et 10% [5]. Malgré tout, leur rôle lors d'une réponse immunitaire n'est pas négligeable. Les monocytes circulant sont recrutés au site inflammatoire, attirés par divers chémoattractants tels que IP-10, MlP-la, MIP-1 (3, MCP-1 et RANTES [5]. Les monocytes peuvent phagocyter les
microorganismes, opsonisés ou non, activant la production d'un stress oxydatif qui contribue à la destruction de la particule étrangère. Par le fait même, ils peuvent aussi agir comme cellule présentatrice d'antigène en favorisant ainsi l'établissement d'une réponse adaptative [5]. Les monocytes sont aussi des précurseurs des macrophages et des cellules dendritiques, résidents des tissus et des muqueuses.
La fixation d'EBV à la surface d'une cellule monocytaire module de manière différentielle la production de cytokines, et ce, indépendamment du récepteur CD21 [77]. En effet, alors que cette interaction inhibe de façon significative la production de TNF-ct dans des lignées monocytaires [77], elle y induit d'autre part la production d'IL-6 et d'IL-ip [78]. De plus, EBV semble, tout comme chez les neutrophiles, sensibiliser les monocytes afin que ceux-ci augmentent leur synthèse de leucotriène B4 lors d'une stimulation subséquente [79]. Ce phénomène est par contre inhibé si le virus est neutralisé par un anticorps dirigé contre la gp350 de l'enveloppe virale. Cette observation pourrait indiquer le rôle crucial du contact EBV-cellule dans cette activité et plus hypothétiquement l'implication de la gp350 [79].
Plusieurs évidences ont aussi confirmé qu'EBV pouvait infecter les monocytes primaires humains et s'y répliquer. Savard et coll. ont notamment observé la présence de transcrits de gènes précoces seulement 5 heures après l'infection et la présence de transcrits de gènes tardifs lyriques environ 20 heures après l'infection [80]. La découverte de génome virale chez des cellules BJAB (EBV-négative normalement) incubées avec un surnageant de culture de monocytes infectés confirme qu'il y a relargage par le monocyte de nouvelles particules infectieuses [80].
3.1.3. Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques («dendritic cells», DCs) sont dérivées des cellules progénitrices de la moelle osseuse. Elles ont comme principales fonctions la présentation antigénique permettant l'activation des lymphocytes, et par le fait même, l'induction de la réponse acquise. Les DCs sont présentes en petite quantité dans les tissus, particulièrement dans la peau et les muqueuses
internes et externes. Elles résident de plus, sous une forme immature, dans le sang périphérique.
Dans le sang périphérique, il existe deux précurseurs distincts pouvant donner naissance aux cellules dendritiques. Le premier représente la population monocytaire (pre-DCl) qui, lorsque mis en culture avec du GM-CSF et de l'IL-4, se différentie en cellules dendritiques conventionnelles (cDCs) [81]. Les cDCs sont constamment à l'inspection des tissus environnants à la recherche d'une éventuelle invasion microbienne, leur attribuant donc un rôle crucial lors du déclenchement de la réponse innée.
Le deuxième précurseur (pre-DC2) provient plutôt de la branche progénitrice lymphoïde et porte à sa surface des marqueurs uniques permettant de distinguer des autres cellules dendritiques; CD41+' IL-SRa^' CD45RA+' HLA-DR+ et CDllc' [82]. Aussi, les pDCs
n'expriment pas les marqueurs myéloïdes (particulièrement le CD21), mais plutôt les marqueurs de lignée lymphoïde (CD2, CD5 et CD7) [83]. La differentiation des pDCs est dirigée en grande partie par la présence de Flt3L («polypeptide deformylase-like tyrosine kinase 3» ligand du Flt3), une cytokine soutenant la différenciation de différents progéniteurs hématopoïétiques, et de G-CSF («granulocytes colony-stimulating factor») [84]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) représentent une rare, mais importante sous-population de cellules immunitaires. La caractéristique principale des pDCs est leur capacité à produire une grande quantité d'interféron de type 1 en réponse à une infection virale, ce qui représente 100 à 1000 fois plus que tous les autres types cellulaires. Suivant une stimulation, les pDCs commencent à produire l'ARN messager servant à la production d'IFN de type 1, transcrit qui n'est pas présent dans des cellules non activées. La production d'IFN accapare par la suite la machinerie transcriptionnelle cellulaire alors que les ARNm produits à cette fin représentent environ 50% des ARNm totaux. Cette fabrication massive ne dure pas plus de 24 heures (revue dans [85]).
Les pDCs expriment en quantité importante le TLR7 et le TLR9 dans leurs endosomes intracellulaires [86]. Ils ont respectivement comme ligands l'ARN simple brin [87, 88] et l'ADN double brin non-méthylé [89, 90]. L'activation de ces récepteurs par les acides
nucléiques viraux induit chez les pDCs une production massive d'IFN-a et -fi. La présence d'IFN mène à la phosphorylation du facteur de translation eIF2 essentiel pour l'initiation de la translation par les ribosomes cellulaires. Ce phénomène inhibe la replication menant à l'apoptose de la cellule infectée. La hausse de la production de p53 induite par l'IFN est un autre processus qui pousse la cellule à entrer en apoptose. L'interféron augmente aussi la présentation des CMH de classe 1, et par le fait même, la présentation possible de peptides viraux (revue dans [91]).
Très peu est connu concernant l'interaction possible entre EBV et les pDCs. Lim et coll. ont tout de même démontré qu'EBV pouvait induire la production d'IFN-a par ce type cellulaire [92]. Ils ont de plus remarqué une certaine relation entre l'activation possible du TLR9 par EBV, mais ceci de manière indirecte. Leur démonstration consistait à incuber EBV en présence de pDCs et de cellules T, cellules qui n'expriment pas le TLR9. Ils ont par la suite évalué la réponse des lymphocytes T par la quantification de l'IFN-y produite par ces cellules. La perturbation de l'activité du TLR9 chez les pDCs par la chloroquine ou l'ODN inhibiteur produit une diminution de la sécrétion d'IFN-y par les cellules T. Cette démonstration ne fait par contre pas la preuve que le génome viral est bel et bien un ligand possible du TLR9.
3.1.4. Les macrophages
Les macrophages sont un produit de la maturation des monocytes lorsque ceux-ci sont recrutés au site inflammatoire. Il existe aussi différents types de macrophages résidents des tissus qui assurent le contrôle primaire des infections. Les macrophages sont des cellules versatiles qui jouent plusieurs rôles importants. Tout d'abord, étant des phagocytes, ils éliminent les cellules mortes ou autres débris non nuisibles. Lors d'une réponse inflammatoire, ils peuvent aussi aider à l'élimination des pathogènes par ce même processus. L'activation cellulaire induit alors la production de cytokines et chémokines médiant la réponse immunitaire et le recrutement d'autres cellules au site infecté. Les microorganismes ingérés et dégradés en peptides seront par la suite présentés aux TCR («T cell receptors») par les CMH de classe II, car les macrophages sont d'excellentes cellules présentatrices d'antigènes.
La présence du génome viral ainsi que l'expression de protéines du cycle lyrique d'EBV ont été détectées dans les macrophages humains, confirmant la capacité du virus à infecter et de se diviser dans ces cellules [93]. À l'opposé des monocytes, l'infection des macrophages in vitro induit l'activation de la voie NF-KB et la production de cytokines pro-inflammatoires. Cette
activité proviendrait notamment de l'association de la gp350 à son récepteur à la surface cellulaire [94]. D'autre part, l'implication des macrophages dans la dissémination d'EBV lors d'infection orale a été suggérée par Tugizov et coll. [95]. Les macrophages et les cellules de Langerhans infectés migrent à travers les diverses couches de la muqueuse pouvant ainsi infecter d'autres cellules. Ceci serait aussi une cause possible de la formation des lésions dans le cas de leucoplasies orales.
3.2. Les récepteurs de l'immunité innée
Capables de distinguer le non-soi du soi, les récepteurs de l'immunité innée reconnaissent différents PAMPs hautement conservés chez les microorganismes. De plus, plusieurs d'entre eux détectent aussi la présence de molécules du soi anormales ou induites lors d'une mort cellulaire par nécrose. La production de cytokines et le déclenchement d'une réponse inflammatoire découlent de l'activation d'un ou plusieurs de ces récepteurs. On retrouve quatre grandes classes de ces récepteurs soient les TLRs («Toll-like receptors»), les NRLs pour «nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors», les RLRs («retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors») ainsi que les CLRs («C-type lectin receptors») (revue dans [96]. Le tableau suivant résume les différents récepteurs, leur localisation et leurs ligands.
Tableau 4: Résumé des classes de récepteurs humains de l'immunité innée, de leur localisation cellulaire et de leurs ligands respectifs
Classes Membres Localisation Ligands TLRs TLR1à 10 Cytosolique, membranaire Voir tableau 5
RLRs DAI Cytosolique Acides nucléiques (ADN)
RIG-I Cytosolique Acides nucléiques (ARN)
MDA5 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)
LGP2 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)
NLRs NOD-1,-2 Cytosolique Composants des parois bactériennes N ALP-1,-3 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)
IPAF Cytosolique Flagelline
NAIP5 Cytosolique Flagelline
ASC Cytosolique Acides nucléiques (ADN)
CLRs FcyR Membranaire Acides nucléiques (ADN et ARN)
Collectines Membranaire Composants des parois bactériennes
Récepteur du Membranaire Composants des parois des mycètes
mannose
DC-SIGN Membranaire Composants des parois des mycètes
Dectin-1,-2 Membranaire Composants des parois des mycètes
CARD9 Membranaire Composants des parois des mycètes Revue dans [96]
3.2.1. Les TLRs
Découverts dans les années 90 [97], les membres de la famille des récepteurs Toll font aussi parties de la grande famille des PRRs («pattern recognition receptors»). Le nom Toll est associé à une protéine structurellement similaire exprimée chez la drosophile qui, à l'origine, jouait un rôle dans le développement de la drosophile. En 1996, on lui attribua aussi un rôle protecteur contre une infection fongique via la reconnaissance de certains peptides microbiens
[98]. Les TLRs sont classés dans la même famille que le récepteur de IL-1 (IL-1R), notamment à cause de leur homologie structurelle et la similitude de la réponse cellulaire retrouvée [97].
IL-1R
TLR
Domaine semblable * auxlg Séquences répétées riches en leucine Domaine extiacellulaîie > • » t •**.» * • • ♦ ♦ • i • • i!» t • • » • « » • 11 • • • • • t ♦ i »:♦.» K M » » •Box1~*
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Membrane cellulaire Domaine TIR Domaine intracellulaire Adaptée de [99] Figure 4: Représentation schématique des TLRs et d' IL-1RLe TLRs et le récepteur de l'IL-1 partagent un domaine intracellulaire semblable alors que la région extracellulaire des TLRs se caractérise par des répétitions riches en leucine.
Semblable pour ces deux types de récepteur, le domaine intracellulaire nommé TIR («Toll-IL- 1R») comprend 3 régions conservées et a une taille d'environ 200 acides aminés. Chez les TLRs, le domaine extracellulaire se compose essentiellement de séquences répétées riches en leucine alors que celui de l'IL-1 R possède un domaine semblable aux immunoglobulines (revue dans [99]). Ce domaine est aussi responsable de la reconnaissance des différents ligands des TLRs. Dix TLRs différents ont été jusqu'à maintenant découverts chez l'homme et
12 globalement chez tous les mammifères (revue dans [100]). À l'exception des erythrocytes, la plupart des types cellulaires expriment en quantité variable un ou plusieurs TLRs à leur surface ou dans les vésicules intracellulaires [101]. Le tableau suivant présente un résumé des
différents TLRs exprimés chez l'humain, leur localisation, leurs ligands ainsi que la protéine adaptatrice utilisée pour la signalisation.
Tableau 5: Tableau résumé des TLRs humains TLRs Localisation Voies de signalisation Ligands TLR1 Membranaire MyD88 (plus TIRAP)
TLR2 Membranaire MyD88 (plus TIRAP)
TLR3 Endosomes TRIF
TLR4 Membranaire MyD88 (plus TIRAP) et TRIF
TLR5 Membranaire MyD88
TLR6 Membranaire MyD88 (plus TIRAP) TLR7 Endosomes MyD88
TLR8 Endosomes MyD88 TLR9 Endosomes MyD88 TLR10 Membranaire MyD88
Lipoprotéines triacylées, actif s'il est hétérodimérisé avec le TLR2 Lipoprotéines di- et tri-acylées PGN et LTA (bactérie)
Zymosan (mycète) HSP-70 (hôte)
ARN double-brin (virus) LPS (bactérie gram-) acide hyaluronique (hôte) HSP-60 et 70 (hôte) Taxol (plante) Flagelline
Lipoprotéines diacylées, actif s'il est hétérodimérisé avec le TLR2, ARN simple brin (virus) ARN simple brin (virus)
ADN double brin à motif CpG non- méthylé (bactérie et virus)
Aucun ligand précis identifié
Adapté de [99] et [100] L'activation des voies de signalisation est déclenchée par la partie intracytoplasmique TIR suite à la reconnaissance d'un ligand par l'autre domaine, celui extracellulaire. La réponse induite par les TLRs se caractérise par le recrutement d'une protéine adaptatrice, soit Myd88 ou TRIF. Il n'y a que le TLR4 qui possède le potentiel d'activer l'une ou l'autre des deux voies. La protéine MyD88 est probablement la plus importante sur le plan immunitaire, car elle est recrutée par tous les TLRs, sauf le TLR3, afin d'induire une réponse inflammatoire. La voie dite MyD88-dépendente active les protéines IRAKs et TRAF6 qui eux induisent par la suite l'activation du complexe IKK (IKB kinase) (revue dans [99]). Chez une cellule naïve, les dimères NF-KB sont retenus dans le cytosol par l'entremise d'interactions non-covalentes avec
les protéines inhibitrices IKBS («Inhibitor fo KB) qui masquent leur site de signal pour la
mène à la phosphorylation et à la dégradation des IKBS et, subséquemment, à la libération des
unités NF-KB. Ces dernières peuvent alors transloquer vers le noyau et activer la transcription
de plusieurs gènes [102]. N F - K B induit notamment la production de plusieurs cytokines pro-
inflammatoires essentielles. Le schéma suivant illustre les cascades de signalisation induites par l'activation des TLRs.
TLR5 TUO/I TLH11 TLR2A6 TLR4 CXI surface Endo&ome TUO TLH7 T U » RAPI TRAF3 IKK complex Nucleus Tirée de [100]
Figure 5: Représentation schématique des voies de signalisation Myd88 et TRIF
L 'activation des TLRs induit une cascade de signalisation intracellulaire menant à la production de plusieurs facteurs de transcription soutenant la synthèse de gènes acteurs de la
3.2.2. TLR2
Les prochaines sections décriront plus en détail les caractéristiques spécificiques du TLR2 et du TLR9, sujets des deux études présentées dans ce manuscrit. Ces deux récepteurs participent activement à la détection des pathogènes, incluant plusieurs virus herpétiques, et à l'activation de l'immunité innée. Leur localisation distinctive appuie de plus l'idée d'une collaboration possible entre ces récepteurs, ceci pouvant alors soutenir une activation plus efficace de la cellule. D'autre part, il est rapporté que l'activation inappropriée du TLR2 et du TLR9 pourrait résulter à l'exacerbation de diverses maladies auto-immunes [103, 104]. Une meilleure compréhension du lien unissant les TLRs et le virus Epstein-Barr saurait peut-être expliquer certains points sombres de la physiopathologie de certaines de ces maladies.
Le TLR 2 est un récepteur membranaire exprimé sur une grande variété de cellules permettant la détection de microorganismes dans le milieu extracellulaire. Les ligands possibles du TLR2 sont très variés; des composantes des parois bactériennes Gram-positive telles que l'acide lipotéichoïque (LTA), le peptidoglycane ou les lipoprotéines, le zymosan de la paroi des mycètes, les glycolipides exprimés chez certains spirochetes ainsi que les porines produites par Neisseria [105-108]. Cependant, le rôle du TLR2 ne se limite pas à la reconnaissance de la paroi des bactéries ou des mycètes alors que plusieurs virus tels que le virus respiratoire syncytial [109], le virus de l'hépatite C [110, 111] ou le virus de la rougeole [112], peuvent aussi activer le TLR2 via l'attachement de certaines protéines virales.
La raison pour laquelle le TLR2 à la capacité de reconnaître une grande variété de ligands peut s'expliquer partiellement via l'hétérodimérisation de ce récepteur avec deux autres TLRs, le TLR1 et le TLR6. Ce phénomène de reconnaissance hétérotypique augmente la spécificité des récepteurs pour une certaine classe de lipopeptide. En effet, l'hétérodimère formé du TLR1 et du TLR2 reconnaît préférentiellement des lipopeptides contenant trois groupements acylés (exemple : la molécule synthétique PamsSCKO alors que les lipopeptides diacylés seront détectés par l'association TLR2/TLR6 [113-115]. De plus, tout comme le TLR4, l'activation optimale du TLR2 peut, dans certains cas, requérir la présence du corécepteur CD 14, par contre sa participation n'est pas essentielle comme dans le cas du TLR4 [116]. De récentes études ont toutefois établi que le rôle du TLR2 ne se limitait pas à l'induction de la voie NF- KB via la reconnaissance d'un ligand à la surface de la cellule. En effet, la stimulation avec le
LTA provoque l'internalisation du TLR2, de son ligand et du corécepteur CD 14 dans le lysosome et par la suite, rapidement dirigé vers le cis-golgi [117]. D'autre part, cette internalisation du TLR2 représente une étape critique lors de l'induction d'IFN-a par les monocytes inflammatoires stimulés avec le virus de la Vaccine [118]. L'utilisation de cytochalasine D, un inhibiteur de l'endocytose, de plus que de la chloroquine, un inhibiteur de l'acidification des endosomes, bloque totalement la production d'IFN. Ce mécanisme semble toutefois être confiné à un certain type cellulaire, c'est-à-dire les monocytes inflammatoires. De plus, cette sécrétion d'IFN-a via le TLR2 s'avère être strictement faite via la reconnaissance virale, alors que l'utilisation de ligands synthétiques ou bactériens n'induit pas cette réponse.
3.2.3. TLR9
Le TLR9 reconnaît son ligand dans les vésicules intracellulaires et son activation mène, tout comme les autres TLRs, à l'induction d'une réponse immunitaire innée, mais aussi adaptative [119]. Le TLR9 lie spécifiquement de l'ADN double-brin possédant des motifs CpG non- méthylés [89, 90]. Ces caractéristiques bien spécifiques sont déterminantes pour la dissociation entre l'ADN de l'hôte et celui étranger. En effet, le contenu en dinucléotides CpG