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Reconnaissance moléculaire du virus Epstein-Barr par les "Toll-like receptors"

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Academic year: 2021

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Reconnaissance moléculaire du virus Epstein-Barr par les

«Toll-like receptors»

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie-immunologie pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se.)

MICROBIOLOGIE-IMMUNOLOGIE FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2010 © Stéphanie Fiola, 2010

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Le TLR2 et le TLR9 sont membres de la famille des «Toll-like receptors» (TLRs), récepteurs de l'immunité innée, pouvant reconnaître divers motifs de microorganismes. Il est connu que ces deux récepteurs peuvent lier différentes composantes de certains virus de la famille des Herpesviridae. Le TLR2, exprimé à la surface de la cellule, peut reconnaître l'herpès simplex, le cytomegalovirus et varicella zoster. Quant au TLR9, il est exprimé dans les vésicules intracellulaires et peut lier l'ADN double brin étranger présent notamment chez les virus herpétiques. Ces données nous ont poussés à vérifier si une telle interaction était observée entre ces récepteurs et le virus Epstein-Barr (EBV). Nous avons tout d'abord établi, dans un modèle in vitro de cellules HEK293 transfectées avec le TLR2 et un plasmide rapporteur

NF-KB-LUC, qu'EBV pouvait activer la voie NF-KB et ce, dépendamment du TLR2. En effet,

l'initiation de la voie NF-KB par le virus peut être abolie par l'utilisation d'anticorps

bloquant/neutralisant contre le TLR2 ou la glycoprotéine 350 (gp350) virale. De plus, nous avons aussi démontré que'EBV pouvait activer la sécrétion de MCP-1 par les monocytes primaires humains, un processus pouvant être inhibé par l'utilisation d'ARNs bloquants contre le TLR2 (SiRNA TLR2). Dans un deuxième temps, nous avons examiné si le génome d'EBV pouvait être reconnu par le TLR9. Les résultats indiquent clairement que les particules intactes d'EBV, ainsi son génome purifié, peuvent induire la sécrétion d'IL-8 par les monocytes humains. Cette induction par l'ADN viral semble de plus être dépendante de l'acidification des endosomes. Le traitement des cellules par un SiRNA TLR2, un ODN inhibiteur du TLR9 ou une combinaison des deux diminue la production d'IL-8, ceci indiquant une coopération probable de ces récepteurs lors de la détection d'EBV. Concernant les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs), qui expriment majoritairement le TLR7 et le TLR9, la stimulation avec EBV ou l'ADN viral purifié induit la production d'IFN-a. Une combinaison d'antagonistes du TLR7 et du TLR9 élimine complètement la sécrétion d'IFN-a, supportant ainsi notre hypothèse voulant que le TLR7 puisse aussi contribuer à cette réponse. En conclusion, les résultats présentés dans ce manuscrit démontrent que la famille des TLRs joue un rôle important dans le déclenchement d'une réponse pro-inflammatoire et antivirale suite à la reconnaissance d'EBV, et que l'activation de multiples TLRs par diverses composantes virales permet probablement de potentialiser l'efficacité de celle-ci.

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Abstract

The Toll-like receptor family is one of the most important members of the pathogen's pattern recognition receptors (PRRs). TLR2 and TLR9 are known to bind different compounds of herpes virus members. Express at the cell surface, TLR2 can recognize envelop proteins of herpes simplex virus, cytomegalovirus and varicella zoster. Within the cell, TLR9 is a resident of endosomal vesicles where it can detect foreign DNA such as herpes virus genome. Supported by these facts, we wanted to explore the responsibility of TLR2 and TLR9 during innate response facing Epstein-Barr virus infection. We have first established, in a HEK293 expressing model transfected with the TLR2 and a NF-KB reporter plasmid, that Epstein-Barr

virus could promote NF-KB activation specifically through TLR2 engagement. Moreover,

treatment with neutralizing antibody against viral protein gp350 or TLR2 impairs the ability of EBV to induce NF-KB pathway. Human primary monocytes can also be activated by EBV

envelop components, a process affected by transfection of siRNA against TLR2 prior to stimulation. In a second time, we evaluated whether EBV DNA could interact with TLR9. Results obtained indicate that complete particles or purified EBV DNA triggers IL-8 secretion by monocytes. Also, DNA activation appears to be mainly dependent of endosomal maturation. Following treatment of cells with siRNA against TLR2 either with inhibitory ODN or both, the IL-8 production by monocytes was found to be affected indicating the possible cooperation between TLR2 and TLR9 for EBV detection. In plasmacytoid dendritic cells (pDCs), which express mainly TLR7 and TLR9, the stimulation with EBV particles or purified viral DNA could induce IFN-a production by those cells. However, we believed that TLR9 is not the only receptor involved in this response. Treatment of pDCs with specific antagonist of TLR7 diminished amount of IFN-a secreted, what sustained the hypothesis that this receptor may be implicated in such process. Taken together, results shown in this manuscript illustrated the critical role of TLRs in Epstein-Barr virus detection during innate response. Moreover, activation of multiple TLRs by different viral components may promote efficient pro-inflammatory and antiviral response against EBV infection.

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Avant-Propos

Je tiens tout d'abord à faire mes remerciements à mon directeur de recherche, le Dr. Jean Gosselin. Les années passées dans son laboratoire m'ont permis de mieux connaître et de mieux comprendre le domaine de la recherche. Les connaissances que j'ai acquises au long de ces années sont innombrables. Je lui suis de plus très reconnaissante pour la confiance et le respect qu'il m'a démontré. Merci aussi à Pierrette qui a toujours été présente pour m'aider et répondre à mes questions.

Je voudrais particulièrement remercier les personnes qui m'ont entouré tout au long de ma maîtrise, c'est-à-dire mes collègues de travail. Merci à Carine avec qui j'ai eu énormément de plaisir à travailler. Merci pour ton support, je savais que je pouvais toujours compter sur toi, et merci pour ta bonne humeur à chaque jour! Merci à Éric d'avoir subi, avec autant de patience, les vagues de questions à mes débuts, et aussi à François M. d'avoir été présent, de m'avoir écouté et supporté pendant ces années. Je voudrais aussi dire merci à Marie-Josée, Anik, Patricia et François C. que j'ai eu le plaisir de côtoyer durant plusieurs mois.

Je ne peux passer sous silence les «Pieds d'athlète» dont plusieurs sont devenus des amis proches. Je vais me souvenir longtemps de nos matchs de soccer, de nos soirées au Pub, de nos soupers et de nos partys mémorables! Merci à tous pour votre amitié.

Pour terminer, j'aimerais remercier les personnes qui sont le plus chères à mon cœur, ma famille. Merci à ma sœur Marie-Christine, qui me comprend mieux que personne et que j'adore! Merci à mes parents qui ont toujours su m'appuyer, qui ont toujours cru en moi. Merci à vous trois de m'avoir écouté et épaulé, et ce, surtout dans les moments les plus difficiles. Merci à mes grands-parents de croire en moi et d'être si fiers de moi. Je vous aime, merci du fond du coeur!

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Résumé i Abstract ii Avant-Propos iii Liste des tableaux v ii

Liste des figures viii Liste des abréviations ix Chapitre 1 : Introduction 1

1. La famille des Herpesviridea 2

2. Le virus Epstein-Barr 4 2.1. Caractéristiques structurelles et fonctionnelles 4

2.1.1. Enveloppe 4 2.1.2. Nucléocapside et tégument 5 2.1.3. Génome 6 2.2. Cycles viraux 8 2.2.1. Phase lyrique 8 2.2.2. Phase de latence 10 2.3. Pathogénèse du virus Epstein-Barr 12

2.3.1. Historique 12 2.3.2. Primo-infection et Mononucléose infectieuse 12

2.3.3. Lymphome de Burkitt 14 2.3.4. Carcinome du nasopharynx 15 2.3.5. Autres cancers associés à la présence d'EBV 15

2.3.6. Maladies auto-immunes 17

3. Le système immunitaire 18 3.1. Immunité innée 19

3.1.1. Les neutrophiles 19 3.1.2. Les monocytes 20 3.1.3. Les cellules dendritiques 21

3.1.4. Les macrophages 23 3.2. Récepteurs de l'immunité innée 24

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3.2.1. Les TLRs 25 3.2.2. Le TLR2 29 3.2.3. Le TLR9 30 3.3. Reconnaissance des virus herpétiques par les TLRs 33

3.3.1. Double reconnaissance virale par les TLRs 35

4. Hypothèse et objectifs de recherche 37

4.1. Hypothèse 37 4.2. Objectif principale 38

4.3. Objectifs spécifiques 38 Chapitre 2 : Le virus Epstein-Barr induit la sécrétion de MCP-1 par les

monocytes humain via l'activation du TLR2 39

Résumé du manuscrit 40 Epstein-Barr virus induces MCP-1 secretion by human monocytes via TLR2 41

Chapitre 3 : Le TLR9 contribue à la reconnaissance du virus Epstein-Barr par les

monocytes primaires et les cellules dendritiques plasmacytoïdes 71

Résumé du manuscrit 72 TLR9 contributes to the recognition of EBV by primary monocytes and plasmacytoid

dendritic cells 73 Chapitre 4: Discussion et conclusion 113

Discussion 113 Conclusion et perspectives 119

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Liste des tableaux

Tableau 1 : Classification des virus herpétiques humains; leur prévalence et pathologies

associées 3 Tableau 2: Fonctions des protéines exprimées lors de la latence d'EBV 11

Tableau 3: Cancers et maladies lymphoprolifératives associés à la présence du virus

Epstein-Barr 16 Tableau 4: Résumé des classes de récepteurs humains de l'immunité innée, de leur

localisation cellulaire et de leurs ligands respectifs 25

Tableau 5: Tableau résumé des TLRs humains 27 Tableau 6: Reconnaissance des virus herpétiques humains par les TLRs 35

(9)

Liste des figures

CHAPITRE 1

Figure 1 : Transcription séquentielle des gènes précoce-immédiats, précoces et tardifs.... 7

Figure 2: Mécanisme de sortie proposé pour le virus Epstein-Barr 10 Figure 3: Schéma de l'interaction EBV-cellule lors de la primo-infection et de la latence

13

Figure 4 : Représentation schématique des TLRs et d'IL-lR 26 Figure 5: Représentation schématique des voies de signalisation Myd88 et TRIF 28

Figure 6: Structure des différentes classes d'ODNs 32 CHAPITRE 2

Figure 1: EBV activates TLR2 in transfected HEK293 cells 65 Figure 2: Blocking experiments inhibit EBV activation of NF-KB in HEK cells

transfected with TLR2 66 Figure 3: EBV is not recognized by TLR4 67

Figure 4: TLR2 activation by EBV is cell binding-dependent 68 Figure 5: CD 14 is not essential for TLR2 activation by EBV 69 Figure 6: EBV stimulation leads to TLR2-dependent secretion of MCP-1 by human

monocytes 70 CHAPITRE 3

Figure 1: EBV modulates TLR9 expression 112 Figure 2: EBV induces TLR9 recruitment within late endosomal compartments in

monocytes 113 Figure 3: Primary human monocytes secrete IL-8 in response to EBV DNA through an

endocytic-dependent pathway 114 Figure 4: Distinctive contribution of TLR2 and TLR9 for cytokine release in

EBV-stimulated monocytes 115 Figure 5: EBV induces secretion of IFNa in pDCs through TLR9 116

Figure 6: Dominant role of TLR9 in pDCs in response to EBV 117 Figure 7: EBV infection of monocytes is influenced by pretreatment with TLR9

inhibitors 118 Figure 8 : EBV does not establish infection in human plasmacytoid dendritic cells 119

Figure 9 : EBV stimulation induces maturation of pDCs independently of TLR7 and

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Liste des abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

ARNm ARN messager

anti-IgG Anti-immunoglobuline G

ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Ca2+ Calcium chargé 2+

CAEBV Infection chronique par EBV CARD Caspase recruitment domain CD Cluster of différenciation

cDCs Cellules dendritiques conventionelles CLRs C-type lectin receptors

CMH Complexe majeur d'histocompatibilité

CMV Cytomegalovirus

CpG Cytosine-Phosphate-Guanine CR2 Récepteur du complément 2 DAI DNA-dependent activator of IRFs

DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3 Non- integrin

-Grabbing

EA Early antigen

EB Epstein-Barr

EBERs Epstein-Barr encoded RNA EBNA Epstein-Barr nuclear antigen

EBNA-LP Epstein-Barr nuclear antigen-leader protein EBV Virus Epstein-Barr (Epstein-Barr virus) eIF2 Eukaryotic initiation factor 2

endo H Endoglycosidase H

FCYR Récepteur des fragments cristallisables gamma Flt3 FMS-like tyrosine kinase 3

Flt3L Ligan du Flt3

gH Glycoprotein H

gL Glycoprotein L

G-CSF Granulocytes colony-stimulating factor

GM-CSF Granulocyte macrophage-colony stimulating factor

gP Glycoprotéine

HEK293 Human embryonic kidney cells 293 HLA-DR Human leukocyte antigen DR

HHV Virus herpès humain (Human herpesvirus) HSP Protéine de choc thermique

HSV Virus herpès simplex (Herpes simplex virus)

IL Interleukine

IL-R Récepteur de l'IL IL-Ra Antagoniste de IL-R

IFN Interferon

(11)

IP-10 IPAF IPCs IRAK kDA KSHV LGP2 LMP LPS LTA MCP-1 MDA5 MS MHV-68 MIP-1 MyD88 MyD88A NAIP5 NALP N.D. N F - K B NK nm NOD NPC NRLs ODN oriP PAA pDCs PGN pH PMA pre-DC PRRs RA RANTES RBP-Jk RE RIG-I RLRs Rta SIDA TCR TIR

Interferon inducible protein 10 ICE-protease-activating factor Interferon producing cells

Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase Kilodalton

Virus humain associé au sarcome de Kaposi (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)

Laboratory of genetics and physiology 2 Latent membrane protein

Lipopolysaccharide Acide lipotéichoïque

Monocyte chemotactic protein-1

Melanoma differentiation associated gene-5 Sclérose en plaque

Ga/M/wa-herpèsvirus murin 68 Macrophage inflammatory protein 1

Myeloid differentiation primary response gene 88 Déficience pour MyD88

Nod-like receptor protein 5 NACHT-, LRR- and pyrin Non-déterminé

Nuclear factor kappa B Natural killer cells Nanometre

Nucleotide-binding oligomerization domain Carcinome du nasopharynx

Nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors Oligodéoxynucléotides

Latent replication origin Acide phosphonoacétique

Cellules dendritiques plasmacytoi'des Peptidoglycane

Potentiel d'hydrogène Phorbol myristate acetate

Précurseur des cellules dendritiques Pattern recognition receptors Arthrite rhumatoïde

Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted Human J kappa recombination signal sequence binding protein Reticulum endoplasmique

Retinoid-inducible gene 1

Retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors

R Epstein-Barr virus replication and transcription activator Syndrome de l'immunodéficience acquise

Récepteurs des cellules T Toll-IL-IR

(12)

TIRAP TLRs TLR7 TNF-a TRAF6 TRIF UL U.V. VCA VIH VP16 VZV Zebra ZREs Zta

Toll-IL-1 Receptor Domain-Containing Adapter Protein Toll-like receptors

Déficience pour le TLR Tumor necrosis factor-alpha

Tumor Necrosis Factor Receptor-associated Factor 6

Toll/IL-1 Receptor Domain-Containing Adaptor-Inducing IFN Séquence unique longue

Ultraviolet

Viral capsid antigen

Virus de l'immunodéficience humaine (Human immunodeficiency virus)

Particules virales

Virus varicella zoster (Varicella-Zoster virus)

Z Epstein-Barr replication and transcription activator Zebra response elements

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Les membres de la famille des Herpesviridae causent des maladies autant chez les humains que chez diverses espèces de mammifères, d'oiseaux et de reptiles. Cette grande diversité est directement liée au système de classification qui est basée, a priori, sur les ressemblances structurelles des virions: la structure icosaédrique de la capside, l'ADN linéaire double brin ainsi que la présence d'une enveloppe glycoprotéique. En plus de ces caractéristiques structurelles, tous les virus herpès partagent quelques propriétés biologiques importantes. Premièrement, il y a présence de plusieurs enzymes métaboliques semblables impliquées dans la synthèse de l'ADN et des acides nucléiques ainsi que dans la synthèse et dégradation protéique. De plus, la synthèse d'ADN ainsi que l'encapsidation se fait dans le noyau de la cellule infectée alors que les étapes subséquentes de l'assemblage se déroulent dans le cytoplasme. Finalement, les Herpesviridae ont la capacité de demeurer en état de latence dans les cellules hôtes [1]. Du point de vue de l'évolution, les virus herpétiques se sont bien adaptés, car l'infection causée n'est généralement pas mortelle pour l'hôte, ce qui assure une transmission efficace à long terme.

Il existe huit types de virus herpétiques humains, aussi nommés «human herpes virus» (HHV). Les Herpesviridae ont été divisés en 3 sous-familles les alpha-, bêta- et gamma-herpesvirinae. Le tableau ci-dessous (tableau 1) résume la classification des divers HHV ainsi que les maladies qui leur sont respectivement associées.

(15)

Sous-famille Nom % individus séropositifs

Pathologies associées Virus herpès simplex 60 à 80 % Infections buccales et

Alpha- (HSV-1 et HSV-2) génitales

herpesvirinae

Virus Varicelle-Zoster (VZV) + de 85 % Varicelle, Zona Cytomegalovirus 75 à 80 % Infections congénitales et

(CMV) périnatales

Beta- Mononucléose infectieuse

herpesvirinae HHV-6 95% Roséole

HHV-7 80% Roséole

Virus Epstein-Barr + de 90 % Mononucléose infectieuse

(EBV)

Gamma-herpesvirinae Virus humain associé au Sarcome 80% Sarcome de Kaposi

de Kaposi Syndrome de Castleman

(KSHV ou HHV-8)

Les virus de la sous-famille des alpha-herpesvirinae se caractérisent par un cycle lyrique court et symptomatique. La phase de latence s'établit dans les ganglions neuronaux. La réactivation peut être fréquente pour HSV-1 et HSV-2, causant pour la plupart du temps des infections aux muqueuses situées à proximité des ganglions touchés. Le zona est la conséquence de la réactivation de VZV. Cette maladie se traduit par une dermatose suivant le parcours des nerfs reliés aux ganglions où il y a eu réactivation. Le cytomegalovirus est un membre important des bêta-herpesvirinae. La primo-infection est, pour la plupart du temps, asymptomatique chez une personne en santé, mais peut parfois se présenter sous forme de mononucléose infectieuse semblable à celle causée par EBV. Se transmettant via les sécrétions, il est responsable de l'infection fœtale congénitale la plus répandue dans les pays industrialisés. HHV6 est l'agent étiologique de la roséole, une maladie infantile très répandue dans le monde. Plus de 90 % de la population est séropositive à l'âge adulte. Une prévalence similaire est observée pour HHV7, mais aucune maladie ne lui a été clairement associée à ce jour. La dernière sous-famille des gamma-herpesvirinae comprend deux virus oncogenes, EBV et HHV8. Ces deux virus lymphotropiques ont un spectre d'hôtes très restreint en comparaison aux autres herpesvirus. HHV8 est souvent étudié dans le contexte du SIDA car il est associé au Sarcome de Kaposi, un cancer cutané qui apparaît généralement chez les individus infectés par le virus

(16)

seront vues plus en détail au cours des prochaines sections.

2. Le virus Epstein-Barr

2.1. Caractéristiques structurelles et fonctionnelles

2.1.1. Enveloppe

L'enveloppe d'EBV est constituée de différentes glycoprotéines, la plus abondante étant la gp350 (gp350/220). Cette composante est principalement impliquée lors de l'adsorption du virion à la surface des cellules cibles en se liant à son récepteur, le récepteur du complément de type 2 (CR2) aussi nommé CD21 [2-4]. Le CD21 interagit normalement avec C3d, molécule particulièrement importante pour la cascade du complément [5]. Ce récepteur est exprimé en grande quantité à la surface des lymphocytes B, mais aussi sur les cellules dendritiques folliculaires et certains types de lymphocytes T [6]. Chez le lymphocyte B, l'interaction entre la gp350 et le CD21 agit non seulement pour l'adsorption du virus, mais aussi, permet le déroulement des étapes subséquentes de l'infection soit l'entrée et la libération de la capside à l'intérieur de la cellule [3]. En effet, la saturation des récepteurs cellulaires par des glycoprotéines virales (gp350) purifiées inhibe la liaison et l'entrée subséquente des virions dans les lymphocytes B [3]. Des résultats semblables ont été obtenus par l'utilisation d'anticorps spécifiques contre le récepteur CD21 [2, 7, 8].

Le complexe gp350-CD21 n'est probablement pas le seul mécanisme utilisé par EBV pour l'attachement si l'on tient compte du fait que plusieurs types cellulaires n'expriment pas à leur surface le CD21. En effet, une étude récente a démontré que, dans la région des voies aériennes supérieures, l'expression du CD21 était restreinte aux cellules épithéliales des amygdales et que le récepteur était absent sur les epitheliums des muqueuses buccales, du palais mou et de la luette [9]. Le lien entre le virus et les cellules déficientes pour le CD21 pourrait alors se faire via l'attachement de la glycoprotéine virale de l'enveloppe BMRF-2 aux intégrines de la famille p i , ce qui faciliterait l'attachement et l'entrée dans les cellules épithéliales de l'oropharynx [10, 11]. Molesworth et coll. ont aussi démontré l'implication que

(17)

épithéliales [12]. (La nomenclature de certaines protéines est basée sur l'homologie des gènes des herpesvirus par rapport à HSV-1, tels que gB, gH ou gL permet de mettre en relation certaines protéines similaires entre membres). Deux mécanismes possibles pour l'entrée des particules virales ont été proposés. Tout d'abord, suite à l'adsorption des virions, il peut y avoir phagocytose de ceux-ci. Ce n'est qu'à la suite de cette étape que la fusion peut avoir lieu dans les vésicules endocytiques. Cette voie est généralement suivie lors de l'infection de lymphocytes B normaux (revue dans [13]). D'un autre côté, il a aussi été démontré, par microscopie électronique, que les virus pouvaient également fusionner directement avec la membrane plasmique de lignées cellulaires de lymphocytes B (revue dans [13, 14]). Il semblerait que ce dernier mécanisme serait aussi impliqué lors de la pénétration d'EBV dans les cellules épithéliales [15].

Le complexe protéique impliqué lors de la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cellulaire est modifié selon la cellule cible. En effet, l'entrée dans les lymphocytes B fait appel à un complexe de trois glycoprotéines virales incluant gH, gL et gp42 [16]. La gp42 lie les complexes majeurs d'histocompatibilité de classe II (CMH II) et agit alors comme un deuxième récepteur d'entrée pour EBV [17]. Par contre, l'infection des cellules épithéliales ne requiert pas la présence de gp42 car les cellules épithéliales n'expriment pas de CMH II. De plus, l'utilisation d'anticorps bloquant dirigés contre cette protéine n'affecte en rien l'entrée du virus [16] alors que la présence de gH et gL est essentielle [15]. Borza et coll. ont démontré que l'interaction des protéines virales de l'enveloppe avec les protéines membranaires cellulaires modulait l'expression de la gp42 selon le type cellulaire et que cette modification établissait alors le tropisme spécifique des virions. D'un autre côté, ils ont aussi fait la démonstration que ce phénotype était réversible et qu'il dépendait du type cellulaire sur lequel les virions étaient cultivés [18].

2.1.2. Nucléocapside et tégument

La nucléocapside d'EBV se compose de 162 capsomères de diverses tailles, la plus abondante étant l'unité P150, et s'organise sous forme icosaédrique d'un diamètre d'environ 100 nm [19]. Elle est entourée d'un tégument contenant des protéines d'origine virale et cellulaire. BPLF-1, une protéine transcrite lors de la phase lyrique de replication et présente dans le tégument,

(18)

responsable de l'activation de la transcription des gènes précoce-immédiats. Le rôle de BPLF-1 n'ayant pas été encore décrit, on peut hypothétiquement penser qu'elle pourrait elle aussi participer à la transcription génique [20]. On y retrouve aussi la protéine BGLF-4 qui agirait notamment sur la phosphorylation et l'activation de BZLF-I, la protéine transactivatrice majeure d'EBV [21]. BNRF-1, une protéine virale importante du tégument, assure un transport efficace de la capside virale au noyau de la cellule, où l'ADN libéré peut pénétrer dans le noyau via les pores nucléaires [22]. BNRF-1 fait partie des cinq protéines propres aux y-herpesvirus qui incluent aussi les protéines BNRF-2, BRRF-2, BDLF-2 et BKRF-4. Ces dernières ne possèdent pas de rôle connu à ce jour [23]. Les protéines d'origine cellulaire représentent une grande proportion des molécules contenues dans le tégument. Ceci inclus Tacrine, les protéines de choc thermique («heat shock protein», HSP) 70 et 90, la cofiline, l'énolase et la fî-tubuline [19]. Les protéines présentent dans le tégument sont importantes pour la modulation de la machinerie transcriptionnelle de l'hôte, la morphologie, la transactivation de gènes viraux, la phosphorylation ainsi que l'empaquetage du matériel génétique [23].

2.1.3 Génome

L'ADN d'EBV est composé d'environ 184 kpb contenant environ 60% de motifs CpG [19]. Il est présent sous forme linéaire double brin dans la capside virale alors que dans le noyau d'une cellule infectée, il est sous forme épisomale, donc non-intégré dans le génome cellulaire. Pour qu'il y ait replication du matériel génétique, EBV utilise la machinerie transcriptionnelle de l'hôte afin de produire les composantes virales nécessaires. On retrouve à la figure 1 un schéma de ces événements de transcription. Les gènes précoce-immédiats (alpha) sont les premiers à être transcrits par la polymerase cellulaire et traduits sous forme de protéines dans le cytosol. Les a/p/ra-protéines sont par la suite retournées dans le noyau afin de permettre la libération des sites promoteurs des gènes immédiats (bêta) qui peuvent alors être aussi transcrits par la polymerase cellulaire. C'est à ce moment que la polymerase virale est produite. Cette dernière sert essentiellement à la production des gènes tardifs (gamma-protéines) lorsque la phase lyrique est déclenchée. Ceux-ci sont majoritairement des composantes structurales du virion ainsi que des protéines du tégument [19].

(19)

f

nlpfmt

«B

+ U ^

t»*eta

+UU

Adapté de [24] Figure 1: Transcription séquentielle des gènes précoce-immédiats, précoces et tardifs

Suite à l'entrée du matériel génétique viral dans le noyau de la cellule hôte, la transcription des gènes immédiat-précoces (alpha) débute à l'aide de la polymerase cellulaire. La traduction de ces ARNs ainsi produits se fait alors au niveau du cytosol (1) et les protéines alpha ainsi produites retournent par la suite au noyau (2). Cette étape est cruciale pour la synthèse subséquente des gènes bêta, qui inclut notamment la polymerase virale (3). Le même trajet est alors effectué par les ARNs et les protéines bêta que celui fait par les alpha. Les protéines bêta nouvellement synthétisées peuvent induire la synthèse des gènes et des protéines tardifs (gamma, 4) via la polymerase nouvellement synthétisée. On retrouve notamment parmi ceux-ci les éléments structurels du virion. L'assemblage se fait dans le cytosol et les nouvelles particules virales formées peuvent sortir par exocytose ou par lyse complète de la cellule infectée.

(20)

2.2.1. Phase lyrique

La phase lyrique est initiée par l'activité de deux protéines transactivatrices virales, codées par le gène BZLF-1, qui, en se liant aux promoteurs des gènes lyriques, activent leur expression [25]. La plus importante se nomme Zebra (aussi appelée Zta, BZLF-1 ou Z). Sa présence est essentielle pour le renversement de la phase de latence vers la phase lyrique ainsi que pour l'activation de la transcription des gènes lyriques tardifs via les ZREs («Zebra response elements») [26, 27]. Plusieurs autres fonctions sont reconnues à Zebra, notamment l'inhibition de la production des gènes de latence [28] et l'arrêt du cycle cellulaire [29]. C'est Zebra qui catalyse aussi la production de l'autre protéine régulatrice: Rta (aussi nommée BRLF-1 ou R). In vitro, la réactivation virale d'EBV est induite par l'activation de la cellule hôte via différents produits tels que le phorbol myristate acétate (PMA) [30], des ionophores Ca2+ [31], des

anti-IgG [32] ou par l'infection avec l'herpesvirus humain 6 [33].

À part les protéines transactivatrices, l'expression de plusieurs autres molécules est essentielle pour qu'il y ait replication: l'ADN polymerase (BALF-5), la protéine d'attachement à l'ADN simple brin BALF-2, la primase BSLF-1, l'hélicase 4 et ses composantes, BBLF-2/BBLF-3 et BMRF-1 [34]. Induite par Zebra, la protéine précoce BMRF-1, qui est responsable de la processivité de l'ADN polymerase virale, joue un rôle essentiel pour la production de ces dernières [35]. On classifie généralement la protéine EBNA-1 comme étant une protéine exprimée lors de la phase latente. Par contre, il a été démontré que cette dernière participerait aussi au bon fonctionnement de la replication virale. Daikoku et ses collaborateurs ont en effet démontré qu'EBNA-1 interagissait possiblement avec l'ADN viral nouvellement synthétisé en se liant à oriP. De plus, l'expression de la protéine a aussi été décelée dans les compartiments de replication virale [36].

La replication de l'ADN viral ainsi que l'assemblage de la nucléocapside d'EBV se déroule à l'intérieur du noyau cellulaire. Les nucléocapsides contenant une copie de l'ADN viral gagnent une première enveloppe par bourgeonnement avec la membrane nucléaire cellulaire. La

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facilitant ainsi la sortie de la capside [37]. Dans un modèle in vitro de cellules HEK293 exprimant le génome recombinant d'EBV, l'absence de BGLF-4 se caractérise particulièrement par la diminution de la quantité de virions produits suite à une réactivation, les particules étant bloquées à la toute première étape de bourgeonnement à la membrane nucléaire [38]. Un rôle semblable a aussi été attribué à BFRF-1, une protéine virale ancrée dans la membrane nucléaire des cellules infectées [39, 40]. Par la suite, les particules se retrouvent dans les régions périnucléaires de la cellule hôte. Deux modèles sont proposés pour expliquer les prochaines étapes de maturation des virions. Tout d'abord, les capsides peuvent migrer via l'appareil sécrétoire de la cellule hôte où il y aura maturation in situ des structures virales. L'autre voie implique qu'il y aurait fusion de l'enveloppe primaire avec la membrane du reticulum endoplasmique, ce qui causerait la perte de l'enveloppe et la libération de la capside nue dans le cytoplasme (figure 1). C'est à ce moment qu'il y aurait recrutement des protéines du tégument. Des études portant sur la maturation des particules de HSV ont démontré qu'il y aurait liaison entre les protéines de la capside et des protéines propres au tégument, comme la molécule UL36. L'attachement subséquent des protéines UL37 et UL48 assurerait le recrutement des autres protéines. La formation du tégument chez EBV n'a pas encore été décrite, par contre l'homologie de certaines de ces protéines partagée entre les membres des virus herpétiques laisse croire à un mécanisme similaire (revue dans [41]. La dernière étape représente le bourgeonnement final vers l'intérieur d'une vésicule du trans-golgi qui apportera le virus pourvu d'une nouvelle enveloppe à l'extérieur de la cellule. Cette dernière enveloppe porte à la fois des protéines membranaires cellulaires, mais aussi plusieurs glycoprotéines virales qui y ont été ancrées suite à leur synthèse. C'est notamment le cas de la gp350, et du complexe gH-gL [19, 41]. Ce dernier mécanisme de sortie reflète plus la réalité en ce qui concerne EBV si l'on considère que les membranes cellulaires des cellules infectées sont riches en gp350, tout comme l'enveloppe des virus matures, alors que les membranes nucléaires en sont dépourvues [42].

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Endoplasmic reticulum

Nucleus

Tiré de [41] Figure 2: Mécanisme de sortie proposé pour le virus Epstein-Barr.

La capside virale passe par différentes étapes d'enveloppement et de ré-enveloppement avant d'être relarguée à l'extérieur de la cellule.

2.2.2. Phase de latence

La latence est établie suite à la primo-infection par EBV et perdure tout au long de la vie de l'individu qui a été infecté. Le matériel génétique circularise se transmet aux cellule-filles lors de la replication de la cellule hôte. Essentiellement, le virus établit sa latence dans les lymphocytes B mémoires circulants où il n'y a que très peu de protéines virales exprimées [43]. Ces protéines sont principalement les «Epstein-Barr nuclear antigen» (EBNA), les «latent membrane protein» (LMP), «BamHIA right frame 0» (BART) ainsi que deux ARNs double brin nommés EBER pour «EBV encoded small RNA» [19]. Il existe trois types de latence qui sont déterminés par l'expression différentielle des protéines de latence, la plus

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répandue étant la latence de type III. Cette dernière se manifeste particulièrement lors de l'immortalisation de lymphocytes B suite à l'infection par EBV ou lors d'un lymphome de Burkitt [19]. L'expression des protéines de latence joue aussi un rôle crucial pour l'immortalisation et la prolifération des cellules infectées. Le tableau 2 résume les principales fonctions des protéines de latence du virus Epstein-Barr.

Tableau 2: Fonctions des protéines exprimées lors de la latence d'EBV

Protéines de latence Fonctions

EBNA-1 EBNA-LP EBNA-2 EBNA-3A, B et C LMP-1 LMP-2A LMP-2B EBERs BART

Nécessaire à la replication et au maintien de l'épisome (*) Potentialisation du pouvoir oncogene du virus (type III) (*) Immortalisation des lymphocytes B (type III) (*)

Immortalisation (A et C). Le complexe EBNA3 inhibe la transcription des gènes activés par EBNA2 et RBP-Jk (type III)(*)

Modification du phénotype de la cellule cible et activation cellulaire (type II et III) [44]

Transformation des lymphocytes B (type II et III)(*) Régulation négative de LMP2A [45]

Aide à l'immortalisation en inhibant l'action de l'interféron. Impliqué lors du traitement de l'ARN (*)

micro ARN, régulation des gènes (ex: LMP1) [46]

(*) Revue dans [6]

2.3. Pathogenèse du virus Epstein-Barr

2.3.1. Historique

La découverte d'EBV, dans les années 50, découle de la caractérisation par le docteur Denis Burkitt d'un type de lymphome particulièrement présent dans la population infantile de l'Ouganda. C'est par l'étude de cellules provenant de ces lymphomes que le virologiste Anthony Epstein et son étudiante Yvonne Barr identifièrent grâce à la microscopie

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électronique un nouveau virus herpétique. Les études qui suivirent démontrèrent qu'EBV possède la capacité d'induire une prolifération in vitro des lymphocytes B humains. C'est en 1967 qu'EBV fut pour la première fois décrite comme étant l'agent étiologique de la mononucléose infectieuse par des collaborateurs du Dr. Epstein; les Dr Werner and Gertrude Henle [47]. À ce jour, plusieurs recherches ont démontré l'implication du virus lors de diverses pathologies. Les prochaines sections traiteront de la pathogenèse du virus pour quelques-unes de celles-ci.

2.3.2. Primo-infection et mononucléose infectieuse

La mononucléose infectieuse est une maladie bénigne liée à l'infection par le virus Epstein-Barr. Physiquement, cela se traduit généralement par divers symptômes tels que la fatigue, la perte de poids, la fièvre, l'inflammation au niveau du pharynx, une splénomégalie et une adénopathie. L'incidence de la mononucléose suite à la primo-infection est d'environ 30 à 50% chez les adolescents. Surnommée «la maladie du baiser», la transmission du virus se fait par contact avec la salive d'une personne infectée. À l'âge adulte, la séropositivité pour EBV atteint plus de 90% dans la population mondiale [48]. Les premières étapes de la primo-infection sont controversées. Alors que certaines recherches énoncent l'hypothèse qu'une replication lyrique au niveau des cellules épithéliales de l'oropharynx est importante pour l'infection subséquente des lymphocytes B, d'autres groupes ont pour leur part démontré qu'il y avait absence du virus dans les cellules épithéliales des amygdales, chez des patients ayant la mononucléose (revue dans [6]). L'infection des lymphocytes B induit notamment la production d'IL-6 et de son récepteur via l'interaction CD21-gp350 [49], cytokine utilisée par les cellules B comme facteur de croissance, facilitant ainsi l'immortalisation future de la cellule hôte [50].

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Les lymphocytes B infectés à la muqueuse migrent par la suite vers les organes lymphoïdes secondaires. Les structures lymphoïdes contiennent une très grande quantité de cellules B, T et cellules dendritiques folliculaires qui peuvent aussi être infectées par le virus [48]. De plus, les organes lymphoïdes étant grandement irrigués, une fraction de cellules infectées peut alors se retrouver dans le sang, phénomène observé chez des patients atteints de mononucléose infectieuse [51]. EBV possède la capacité d'infecter diverses cellules du sang périphérique et d'induire une production massive de cytokines pro-inflammatoires [52], ce qui accentue probablement plusieurs symptômes de la primo-infection comme la fièvre, la fatigue, l'adénopathie et la splénomégalie. Finalement, lorsque le patient entre dans la phase de rémission, la production de nouveaux virions chute considérablement.

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Tirée de [42]

Figure 3: Schéma de l'interaction EBV-cellule lors de la primo-infection et de la latence.

Le premier contact se fait via l'épithélium buccal où les lymphocytes B et les cellules épithéliales peuvent être infectés. Suite à la latence, il peut avoir réactivation du cycle lytique et sécrétion de particules infectieuses.

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Le virus n'est par contre jamais réellement éliminé de l'organisme, car EBV établit sa latence dans les cellules B, qui pourront se différencier subséquemment en cellules mémoires. Celles-ci pourront retourner périodiquement dans les ganglions des voies aériennes (l'anneau de Waldeyer). Une réactivation subséquente des lymphocytes mémoires en plasmocytes pourrait initier de nouveau la phase lyrique virale et une production de virions [53]. La transmission du virus d'une personne à l'autre est alors possible, car une certaine quantité de virus peut se retrouver dans la salive [54].

Le virus Epstein-Barr est aussi relié à d'autres maladies, par exemple l'infection chronique par EBV (CAEBV). Cette dernière se caractérise par l'apparition périodique, voire même permanente, des symptômes spécifiques de la mononucléose infectieuse chez des hôtes immunocompétents[55]. Les personnes atteintes démontrent un fort titre viral dans le sang périphérique et, contrairement à la primo-infection, les lymphocytes T et les cellules NK («natural killer cells») sont aussi infectés. L'expansion clonale de ces cellules semblerait jouer un rôle central dans le déroulement de la maladie.

2.3.3. Lymphome de Burkitt

Le lymphome de Burkitt (BL) se caractérise par la prolifération agressive des lymphocytes de type B. Les différents variants des BL se distinguent par leurs caractéristiques géographiques (dits endémiques), biologiques (dits sporadiques) et immunologiques (associé à l'immunodéficience de l'hôte). Les lymphomes de Burkitt retrouvés en Amérique et en Europe de l'ouest forment la classe de lymphomes dits sporadiques. Ceux-ci sont rarement associés au virus Epstein-Barr alors que l'incidence de séropositivité ne représente que 1 à 2% des cas, d'où l'appellation sporadique [56]. Ils se développent généralement dans la région abdominale affectant l'appareil digestif, les ganglions abdominaux et, à moindre fréquence, les reins, le pancréas, le foie, la rate, les seins et les ovaires [56]. La forme dite endémique des lymphomes de Burkitt se distingue par son association à plus de 95% avec l'infection par EBV. Elle sévit principalement chez de jeunes enfants d'Afrique équatoriale [56] et apparaît dans la plupart des cas dans les régions maxillaires. Les cas de lymphomes endémiques ont aussi la particularité d'être majoritairement présents dans les régions géographiques hyperendémiques pour la malaria. On peut alors s'interroger sur l'impact de la co-infection EBV et Plasmodium

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Falciparum dans la pathologie du lymphome [57]. Par contre, ce lien est hypothétique. Finalement, le dernier variant de lymphome connu est en relation avec l'hôte immunosupprimé. L'infection par EBV représente un des facteurs clés pour la progression des lymphomes B chez les personnes atteintes du VIH alors qu'environ 30% des BL sont séropositifs pour EBV [57].

2.3.4. Carcinome du nasopharynx

Le carcinome du nasopharynx (NPC) est un cancer qui se localise dans voies respiratoires supérieures et origine des cellules du tissu epithelial des muqueuses. L'apparition de ce type de cancer peut être reliée à des prédispositions génétiques, à l'exposition à des substances cancérigènes ou une infection préexistante par le virus Epstein-Barr [58]. On note une incidence particulièrement élevée de ce cancer en Asie du Sud-est et en Afrique du Nord [6]. Dans la plupart des cas décrits dans ces régions, ceux-ci se caractérisent par leur séropositivité pour EBV. L'alimentation, la culture ainsi que certaines prédispositions génétiques pourraient expliquer ce confinement géographique spécifique. Les carcinomes EBV positifs sont retrouvés principalement dans les kératinocytes non-différenciées. Ces cellules sont reconnaissables par la forme ronde ou ovale de leur noyau et nucléole, distinctivement des cellules différenciées [6]. On note aussi la présence d'anticorps, IgG et IgA, dirigés contre la capside (VCA) et l'enveloppe virale (EA) d'EBV dans le sérum de patients atteints du NPC, ainsi que la présence du génome dans les cellules cancéreuses (revue dans [58]). Il est clair qu'EBV joue un rôle dans la pathogenèse du NPC par contre, il ne semble pas que celui-ci soit l'agent causal de la formation du carcinome [59].

2.3.5. Autres cancers associés à EBV

Bien que l'étiologie du virus Epstein-Barr n'ait pas encore été démontrée, plusieurs évidences tendent à suggérer que ce dernier pourrait jouer un rôle dans le développement de différents types de cancer. Outre le BL et le NPC, le virus Epstein-Barr est aussi associé à d'autres types de tumeurs. Le lymphome d'Hodgkin est l'un de ceux-ci. Ce lymphome s'attaque généralement aux organes lymphoïdes, à la moelle osseuse et au foie. La proportion de lymphomes associés à EBV représentent environ 30% des cas dits classiques de la maladie [60]. De plus, l'hypothèse que le virus Epstein-Barr puisse être indirectement lié au cancer du sein a

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récemment été soulevée (revue dans [61]). Trabelsi et coll. ont en effet démontré la présence du génome viral dans les cellules cancéreuses épithéliales du cancer du sein, alors que les cellules épithéliales non-tumorales ainsi que les cellules des organes lymphoïdes étaient toutes négatives [62]. Le tableau 3 résume les différents cancers et maladies ayant été associés à la présence du virus Epstein-Barr.

Tableau 3: Cancers et maladies lymphoprolifératives associés à la présence d'EBV

Hôtes Type cellulaire Maladie

Immunosupprimés Lymphocytes B Mesenchyme Immunocompetents Lymphocytes B Lymphocytes T Cellules épithéliales Mesenchyme

Lymphome associé au VIH Désordre lymphoprolifératif post-transplantation

Granulomatose lymphomatoïde Lymphome B associé au Methotrexate Syndrome Wiskott-Aldrich (Lymphome B) Désordre lymphoprolifératif associé au chromosome X (Lymphome B)

Léiomyosarcome Lymphome de Burkitt

Lymphome classique de la maladie d'Hodgkin Lymphome NK/T extra-ganglionnaire, type nasal Syndrome d'hémophagocytose reliée aux

lymphomes T associés à EBV Carcinome du nasopharynx Carcinome lympho-épithéliale Cancer du sein

Carcinome hépatocellulaire

Sarcome des cellules dendritiques folliculaire

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2.3.6. Maladies auto-immunes

Une maladie dite auto-immune est induite lors d'un dérèglement du système immunitaire, la plupart du temps lors d'une hyperactivation de ce dernier. Ce dysfonctionnement provoque une réponse immunitaire contre des éléments du soi. L'apparition de maladies auto-immunes peut provenir de multiples facteurs tels qu'une prédisposition génétique, l'impact environnemental ou l'infection par un microorganisme. Le virus Epstein-Barr est reconnu aujourd'hui comme un acteur potentiel dans la pathogenèse d'importantes maladies auto-immunes. On compte parmi celles-ci la sclérose en plaques (MS) ainsi que l'arthrite rhumatoïde (RA).

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central se déclarant généralement au début de l'âge adulte. L'hypothèse de l'implication d'EBV a tout d'abord été émise suite à la découverte d'un titre d'anticorps anti-EBV anormalement élevé dans le sérum de patients atteints de MS [63]. Plusieurs études épidémiologiques ont aussi prouvé cette hypothèse en démontrant une corrélation entre un antécédent de mononucléose infectieuse par EBV et la MS (revue dans [64]). À ce jour, plusieurs mécanismes ont été énoncés afin d'expliquer ce lien. Par exemple, le virus code pour certaines protéines partageant une grande homologie avec des protéines du soi. La sélection positive des cellules CD4+

dirigées contre les antigènes viraux favorise par le fait même la possibilité d'une réaction croisée entre ces mêmes cellules et des antigènes homologues du soi, créant ainsi une réponse auto-immune non favorable chez les patients [65].

L'arthrite rhumatoïde (AR) est une maladie inflammatoire des articulations. Tout comme la MS, l'AR implique non seulement l'hérédité, telle que certains alleles des HLA-DR, mais aussi plusieurs facteurs environnementaux comme l'implication d'agents infectieux. Malgré le fait qu'EBV possède toutes les caractéristiques pour une association potentielle avec la pathogenèse de l'arthrite, aucun lien direct et précis n'a encore démontré quant à son rôle dans le développement ou la progression de la maladie. On note tout de même plusieurs éléments les reliant; une augmentation d'anticorps anti-EBNA, -VCA et -EA dans le sérum des individus arthritiques, la présence de transcrits d'ARN viraux lors d'hybridation in situ dans les tissus synoviaux et une augmentation du pourcentage de séropositivité pour EBV dans les cellules du sang périphérique, la salive ainsi que le liquide et les tissus synoviaux d'individus

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arthritiques (revue dans [66]). De plus, l'incapacité d'un contrôle adéquat de l'infection par le virus Epstein-Barr chez les personnes atteintes d'AR les surexposent aux antigènes viraux et, par le fait même, stimule de manière excessive la réponse immunitaire [67]. Cet état d'inflammation chronique pourrait alors jouer un rôle dans le développement ou la sévérité de la maladie.

3. Le système immunitaire

Notre système immunitaire est régulé par des mécanismes complexes qui permettent à notre corps de se défendre contre les pathogènes. La peau et les muqueuses sont nos toutes premières barrières physiques qui empêchent les pathogènes d'entrer dans l'organisme. Outre l'obstacle que constituent les matrices de cellules difficilement franchissables, divers composés sont aussi produits afin de détruire les microorganismes. On compte parmi ceux-ci les acides gras et les acides lactiques sécrétés par la peau qui lui confère une certaine acidité, inhibant l'implantation de microorganismes étrangers. D'autre part, le mucus produit par les cellules caliciformes des muqueuses permet non seulement de conserver l'hydratation des structures épithéliales, mais aussi, bloque le cheminement des particules à travers les différentes voies du corps humain. Nos flores microbiennes résidentes aident aussi à combattre les pathogènes en produisant des substances toxiques pour ceux-ci ou en compétitionnant pour la disponibilité des nutriments.

Le bris d'une barrière physique offre l'opportunité aux microorganismes de pénétrer dans l'organisme de l'hôte. C'est alors qu'est déclenchée la deuxième barrière immunitaire: l'immunité innée. Notons que l'immunité innée repose essentiellement sur une réponse non spécifique suite à l'invasion de microorganismes médiée par plusieurs composantes dont certaines seront vues plus en détail dans les prochaines sections.

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3.1 Immunité innée

L'immunité innée est déclenchée invariablement lors de toutes infections microbiennes. Elle comprend différents types cellulaires et mécanismes qui agissent de manière non spécifique pour éliminer le microorganisme étranger. Elle est induite lors de la reconnaissance de motifs spécifiques aux pathogènes, aussi nommés PAMPs pour «pathogen-associated molecular patterns», par différents récepteurs cellulaires nommés PRRs («pattern recognition receptors») ou par l'opsonisation des pathogènes.

La base du système immunitaire repose principalement sur la réponse de différents types cellulaires qui originent des cellules pluripotentes de la moelle osseuse: les cellules hématopoïétiques. Ces cellules souches donnent naissance à deux différents types de précurseurs peu différenciés nommés précurseurs lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules de l'immunité innée originant de la branche lymphoïde sont les cellules NK («natural killer»), ainsi que les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Cet embranchement donne aussi naissance aux lymphocytes B et T, principales populations constituant le système adaptatif. La voie myéloïde est responsable de la formation des leucocytes polymorphonucléaires, soient les neutrophiles, les basophiles et les éosinophiles. Ce même précurseur peut aussi donner naissance aux cellules mononuclées telles que les mastocytes, les cellules dendritiques, les monocytes et les macrophages. Les erythrocytes et les plaquettes dérivent aussi du groupe myéloïde [5]. Les sections suivantes traiteront des types cellulaires de l'immunité innée en relation avec l'infection par EBV.

3.1.1. Les neutrophiles

Les neutrophiles constituent le type cellulaire le plus abondant des cellules sanguines et participent aux événements précoces de l'inflammation. Ils sont en effet les premiers à être recrutés par chimiotaxie au site d'infection entre autres par l'IL-8, une chimiokine produite par

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les phagocytes ou les cellules endothéliales activées [5]. Leurs implications dans le processus inflammatoire sont diversifiées, pouvant agir comme phagocyte ou alors par la libération de molécules antimicrobiennes lors d'un mécanisme nommé dégranulation. La phagocytose faite par les neutrophiles produit un stress oxydatif qui favorise l'éradication du microorganisme, ce qui a d'ailleurs été observé lors de l'infection par le virus Herpès Simplex (HSV) [68]. Les neutrophiles peuvent aussi relarguer divers médiateurs antimicrobiens et sécréter une gamme variée de cytokines, augmentant ainsi l'efficacité de la réponse immunitaire (revue dans [69, 70]).

Nous avons démontré au laboratoire qu'EBV pouvait modifier le cours normal de la vie d'un neutrophile humain en induisant prématurément le processus apoptotique de ce dernier [71]. Lors de cette même étude, il a de plus été démontré qu'EBV pouvait infecter le neutrophile, et ce, par la visualisation de particules virales au niveau du cytoplasme et du noyau des cellules infectées. Par contre, cette infection ne mène vraisemblablement pas à l'établissement d'une phase lyrique alors qu'aucun transcrit lyrique n'a été détecté. L'induction d'une mort prématurée des neutrophiles par EBV pourrait constituer un avantage pour le virus en affaiblissant l'efficacité de la réponse immune lors des premières heures de l'infection. En plus d'induire l'apoptose, EBV déclenche aussi la synthèse de nouvelles protéines cellulaires et la production de plusieurs cytokines comme l'l-ct, 1-0, l'antagoniste du récepteur de IL-1 (IL-IRa), l'IL-8 ainsi que MlP-la [70, 72, 73]. D'autre part, la biosynthèse du leucotriène B4, un médiateur reconnu pour ses propriétés antivirales [74, 75], est augmentée lors de la stimulation d'une cellule infectée par EBV [76], révélant peut-être un rôle important dans le contrôle de la dissémination d'EBV.

3.1.2. Les monocytes

Les monocytes représentent une sous-population des cellules mononuclées du sang périphérique qui ne forme qu'un faible pourcentage des cellules totales, soit entre 5 et 10% [5]. Malgré tout, leur rôle lors d'une réponse immunitaire n'est pas négligeable. Les monocytes circulant sont recrutés au site inflammatoire, attirés par divers chémoattractants tels que IP-10, MlP-la, MIP-1 (3, MCP-1 et RANTES [5]. Les monocytes peuvent phagocyter les

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microorganismes, opsonisés ou non, activant la production d'un stress oxydatif qui contribue à la destruction de la particule étrangère. Par le fait même, ils peuvent aussi agir comme cellule présentatrice d'antigène en favorisant ainsi l'établissement d'une réponse adaptative [5]. Les monocytes sont aussi des précurseurs des macrophages et des cellules dendritiques, résidents des tissus et des muqueuses.

La fixation d'EBV à la surface d'une cellule monocytaire module de manière différentielle la production de cytokines, et ce, indépendamment du récepteur CD21 [77]. En effet, alors que cette interaction inhibe de façon significative la production de TNF-ct dans des lignées monocytaires [77], elle y induit d'autre part la production d'IL-6 et d'IL-ip [78]. De plus, EBV semble, tout comme chez les neutrophiles, sensibiliser les monocytes afin que ceux-ci augmentent leur synthèse de leucotriène B4 lors d'une stimulation subséquente [79]. Ce phénomène est par contre inhibé si le virus est neutralisé par un anticorps dirigé contre la gp350 de l'enveloppe virale. Cette observation pourrait indiquer le rôle crucial du contact EBV-cellule dans cette activité et plus hypothétiquement l'implication de la gp350 [79].

Plusieurs évidences ont aussi confirmé qu'EBV pouvait infecter les monocytes primaires humains et s'y répliquer. Savard et coll. ont notamment observé la présence de transcrits de gènes précoces seulement 5 heures après l'infection et la présence de transcrits de gènes tardifs lyriques environ 20 heures après l'infection [80]. La découverte de génome virale chez des cellules BJAB (EBV-négative normalement) incubées avec un surnageant de culture de monocytes infectés confirme qu'il y a relargage par le monocyte de nouvelles particules infectieuses [80].

3.1.3. Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques («dendritic cells», DCs) sont dérivées des cellules progénitrices de la moelle osseuse. Elles ont comme principales fonctions la présentation antigénique permettant l'activation des lymphocytes, et par le fait même, l'induction de la réponse acquise. Les DCs sont présentes en petite quantité dans les tissus, particulièrement dans la peau et les muqueuses

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internes et externes. Elles résident de plus, sous une forme immature, dans le sang périphérique.

Dans le sang périphérique, il existe deux précurseurs distincts pouvant donner naissance aux cellules dendritiques. Le premier représente la population monocytaire (pre-DCl) qui, lorsque mis en culture avec du GM-CSF et de l'IL-4, se différentie en cellules dendritiques conventionnelles (cDCs) [81]. Les cDCs sont constamment à l'inspection des tissus environnants à la recherche d'une éventuelle invasion microbienne, leur attribuant donc un rôle crucial lors du déclenchement de la réponse innée.

Le deuxième précurseur (pre-DC2) provient plutôt de la branche progénitrice lymphoïde et porte à sa surface des marqueurs uniques permettant de distinguer des autres cellules dendritiques; CD41+' IL-SRa^' CD45RA+' HLA-DR+ et CDllc' [82]. Aussi, les pDCs

n'expriment pas les marqueurs myéloïdes (particulièrement le CD21), mais plutôt les marqueurs de lignée lymphoïde (CD2, CD5 et CD7) [83]. La differentiation des pDCs est dirigée en grande partie par la présence de Flt3L («polypeptide deformylase-like tyrosine kinase 3» ligand du Flt3), une cytokine soutenant la différenciation de différents progéniteurs hématopoïétiques, et de G-CSF («granulocytes colony-stimulating factor») [84]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) représentent une rare, mais importante sous-population de cellules immunitaires. La caractéristique principale des pDCs est leur capacité à produire une grande quantité d'interféron de type 1 en réponse à une infection virale, ce qui représente 100 à 1000 fois plus que tous les autres types cellulaires. Suivant une stimulation, les pDCs commencent à produire l'ARN messager servant à la production d'IFN de type 1, transcrit qui n'est pas présent dans des cellules non activées. La production d'IFN accapare par la suite la machinerie transcriptionnelle cellulaire alors que les ARNm produits à cette fin représentent environ 50% des ARNm totaux. Cette fabrication massive ne dure pas plus de 24 heures (revue dans [85]).

Les pDCs expriment en quantité importante le TLR7 et le TLR9 dans leurs endosomes intracellulaires [86]. Ils ont respectivement comme ligands l'ARN simple brin [87, 88] et l'ADN double brin non-méthylé [89, 90]. L'activation de ces récepteurs par les acides

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nucléiques viraux induit chez les pDCs une production massive d'IFN-a et -fi. La présence d'IFN mène à la phosphorylation du facteur de translation eIF2 essentiel pour l'initiation de la translation par les ribosomes cellulaires. Ce phénomène inhibe la replication menant à l'apoptose de la cellule infectée. La hausse de la production de p53 induite par l'IFN est un autre processus qui pousse la cellule à entrer en apoptose. L'interféron augmente aussi la présentation des CMH de classe 1, et par le fait même, la présentation possible de peptides viraux (revue dans [91]).

Très peu est connu concernant l'interaction possible entre EBV et les pDCs. Lim et coll. ont tout de même démontré qu'EBV pouvait induire la production d'IFN-a par ce type cellulaire [92]. Ils ont de plus remarqué une certaine relation entre l'activation possible du TLR9 par EBV, mais ceci de manière indirecte. Leur démonstration consistait à incuber EBV en présence de pDCs et de cellules T, cellules qui n'expriment pas le TLR9. Ils ont par la suite évalué la réponse des lymphocytes T par la quantification de l'IFN-y produite par ces cellules. La perturbation de l'activité du TLR9 chez les pDCs par la chloroquine ou l'ODN inhibiteur produit une diminution de la sécrétion d'IFN-y par les cellules T. Cette démonstration ne fait par contre pas la preuve que le génome viral est bel et bien un ligand possible du TLR9.

3.1.4. Les macrophages

Les macrophages sont un produit de la maturation des monocytes lorsque ceux-ci sont recrutés au site inflammatoire. Il existe aussi différents types de macrophages résidents des tissus qui assurent le contrôle primaire des infections. Les macrophages sont des cellules versatiles qui jouent plusieurs rôles importants. Tout d'abord, étant des phagocytes, ils éliminent les cellules mortes ou autres débris non nuisibles. Lors d'une réponse inflammatoire, ils peuvent aussi aider à l'élimination des pathogènes par ce même processus. L'activation cellulaire induit alors la production de cytokines et chémokines médiant la réponse immunitaire et le recrutement d'autres cellules au site infecté. Les microorganismes ingérés et dégradés en peptides seront par la suite présentés aux TCR («T cell receptors») par les CMH de classe II, car les macrophages sont d'excellentes cellules présentatrices d'antigènes.

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La présence du génome viral ainsi que l'expression de protéines du cycle lyrique d'EBV ont été détectées dans les macrophages humains, confirmant la capacité du virus à infecter et de se diviser dans ces cellules [93]. À l'opposé des monocytes, l'infection des macrophages in vitro induit l'activation de la voie NF-KB et la production de cytokines pro-inflammatoires. Cette

activité proviendrait notamment de l'association de la gp350 à son récepteur à la surface cellulaire [94]. D'autre part, l'implication des macrophages dans la dissémination d'EBV lors d'infection orale a été suggérée par Tugizov et coll. [95]. Les macrophages et les cellules de Langerhans infectés migrent à travers les diverses couches de la muqueuse pouvant ainsi infecter d'autres cellules. Ceci serait aussi une cause possible de la formation des lésions dans le cas de leucoplasies orales.

3.2. Les récepteurs de l'immunité innée

Capables de distinguer le non-soi du soi, les récepteurs de l'immunité innée reconnaissent différents PAMPs hautement conservés chez les microorganismes. De plus, plusieurs d'entre eux détectent aussi la présence de molécules du soi anormales ou induites lors d'une mort cellulaire par nécrose. La production de cytokines et le déclenchement d'une réponse inflammatoire découlent de l'activation d'un ou plusieurs de ces récepteurs. On retrouve quatre grandes classes de ces récepteurs soient les TLRs («Toll-like receptors»), les NRLs pour «nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors», les RLRs («retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors») ainsi que les CLRs («C-type lectin receptors») (revue dans [96]. Le tableau suivant résume les différents récepteurs, leur localisation et leurs ligands.

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Tableau 4: Résumé des classes de récepteurs humains de l'immunité innée, de leur localisation cellulaire et de leurs ligands respectifs

Classes Membres Localisation Ligands TLRs TLR1à 10 Cytosolique, membranaire Voir tableau 5

RLRs DAI Cytosolique Acides nucléiques (ADN)

RIG-I Cytosolique Acides nucléiques (ARN)

MDA5 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)

LGP2 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)

NLRs NOD-1,-2 Cytosolique Composants des parois bactériennes N ALP-1,-3 Cytosolique Acides nucléiques (ARN)

IPAF Cytosolique Flagelline

NAIP5 Cytosolique Flagelline

ASC Cytosolique Acides nucléiques (ADN)

CLRs FcyR Membranaire Acides nucléiques (ADN et ARN)

Collectines Membranaire Composants des parois bactériennes

Récepteur du Membranaire Composants des parois des mycètes

mannose

DC-SIGN Membranaire Composants des parois des mycètes

Dectin-1,-2 Membranaire Composants des parois des mycètes

CARD9 Membranaire Composants des parois des mycètes Revue dans [96]

3.2.1. Les TLRs

Découverts dans les années 90 [97], les membres de la famille des récepteurs Toll font aussi parties de la grande famille des PRRs («pattern recognition receptors»). Le nom Toll est associé à une protéine structurellement similaire exprimée chez la drosophile qui, à l'origine, jouait un rôle dans le développement de la drosophile. En 1996, on lui attribua aussi un rôle protecteur contre une infection fongique via la reconnaissance de certains peptides microbiens

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[98]. Les TLRs sont classés dans la même famille que le récepteur de IL-1 (IL-1R), notamment à cause de leur homologie structurelle et la similitude de la réponse cellulaire retrouvée [97].

IL-1R

TLR

Domaine semblable * auxlg Séquences répétées riches en leucine Domaine extiacellulaîie > • » t •**.» * • • ♦ ♦ • i • • i!» t • • » • « » • 11 • • • • • t ♦ i »:♦.» K M » » •

Box1~*

Box2-*

Box3-^

Membrane cellulaire Domaine TIR Domaine intracellulaire Adaptée de [99] Figure 4: Représentation schématique des TLRs et d' IL-1R

Le TLRs et le récepteur de l'IL-1 partagent un domaine intracellulaire semblable alors que la région extracellulaire des TLRs se caractérise par des répétitions riches en leucine.

Semblable pour ces deux types de récepteur, le domaine intracellulaire nommé TIR («Toll-IL-1R») comprend 3 régions conservées et a une taille d'environ 200 acides aminés. Chez les TLRs, le domaine extracellulaire se compose essentiellement de séquences répétées riches en leucine alors que celui de l'IL-1 R possède un domaine semblable aux immunoglobulines (revue dans [99]). Ce domaine est aussi responsable de la reconnaissance des différents ligands des TLRs. Dix TLRs différents ont été jusqu'à maintenant découverts chez l'homme et

12 globalement chez tous les mammifères (revue dans [100]). À l'exception des erythrocytes, la plupart des types cellulaires expriment en quantité variable un ou plusieurs TLRs à leur surface ou dans les vésicules intracellulaires [101]. Le tableau suivant présente un résumé des

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différents TLRs exprimés chez l'humain, leur localisation, leurs ligands ainsi que la protéine adaptatrice utilisée pour la signalisation.

Tableau 5: Tableau résumé des TLRs humains TLRs Localisation Voies de signalisation Ligands TLR1 Membranaire MyD88 (plus TIRAP)

TLR2 Membranaire MyD88 (plus TIRAP)

TLR3 Endosomes TRIF

TLR4 Membranaire MyD88 (plus TIRAP) et TRIF

TLR5 Membranaire MyD88

TLR6 Membranaire MyD88 (plus TIRAP) TLR7 Endosomes MyD88

TLR8 Endosomes MyD88 TLR9 Endosomes MyD88 TLR10 Membranaire MyD88

Lipoprotéines triacylées, actif s'il est hétérodimérisé avec le TLR2 Lipoprotéines di- et tri-acylées PGN et LTA (bactérie)

Zymosan (mycète) HSP-70 (hôte)

ARN double-brin (virus) LPS (bactérie gram-) acide hyaluronique (hôte) HSP-60 et 70 (hôte) Taxol (plante) Flagelline

Lipoprotéines diacylées, actif s'il est hétérodimérisé avec le TLR2, ARN simple brin (virus) ARN simple brin (virus)

ADN double brin à motif CpG non-méthylé (bactérie et virus)

Aucun ligand précis identifié

Adapté de [99] et [100] L'activation des voies de signalisation est déclenchée par la partie intracytoplasmique TIR suite à la reconnaissance d'un ligand par l'autre domaine, celui extracellulaire. La réponse induite par les TLRs se caractérise par le recrutement d'une protéine adaptatrice, soit Myd88 ou TRIF. Il n'y a que le TLR4 qui possède le potentiel d'activer l'une ou l'autre des deux voies. La protéine MyD88 est probablement la plus importante sur le plan immunitaire, car elle est recrutée par tous les TLRs, sauf le TLR3, afin d'induire une réponse inflammatoire. La voie dite MyD88-dépendente active les protéines IRAKs et TRAF6 qui eux induisent par la suite l'activation du complexe IKK (IKB kinase) (revue dans [99]). Chez une cellule naïve, les dimères NF-KB sont retenus dans le cytosol par l'entremise d'interactions non-covalentes avec

les protéines inhibitrices IKBS («Inhibitor fo KB) qui masquent leur site de signal pour la

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mène à la phosphorylation et à la dégradation des IKBS et, subséquemment, à la libération des

unités NF-KB. Ces dernières peuvent alors transloquer vers le noyau et activer la transcription

de plusieurs gènes [102]. N F - K B induit notamment la production de plusieurs cytokines

pro-inflammatoires essentielles. Le schéma suivant illustre les cascades de signalisation induites par l'activation des TLRs.

TLR5 TUO/I TLH11 TLR2A6 TLR4 CXI surface Endo&ome TUO TLH7 T U » RAPI TRAF3 IKK complex Nucleus Tirée de [100]

Figure 5: Représentation schématique des voies de signalisation Myd88 et TRIF

L 'activation des TLRs induit une cascade de signalisation intracellulaire menant à la production de plusieurs facteurs de transcription soutenant la synthèse de gènes acteurs de la

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3.2.2. TLR2

Les prochaines sections décriront plus en détail les caractéristiques spécificiques du TLR2 et du TLR9, sujets des deux études présentées dans ce manuscrit. Ces deux récepteurs participent activement à la détection des pathogènes, incluant plusieurs virus herpétiques, et à l'activation de l'immunité innée. Leur localisation distinctive appuie de plus l'idée d'une collaboration possible entre ces récepteurs, ceci pouvant alors soutenir une activation plus efficace de la cellule. D'autre part, il est rapporté que l'activation inappropriée du TLR2 et du TLR9 pourrait résulter à l'exacerbation de diverses maladies auto-immunes [103, 104]. Une meilleure compréhension du lien unissant les TLRs et le virus Epstein-Barr saurait peut-être expliquer certains points sombres de la physiopathologie de certaines de ces maladies.

Le TLR 2 est un récepteur membranaire exprimé sur une grande variété de cellules permettant la détection de microorganismes dans le milieu extracellulaire. Les ligands possibles du TLR2 sont très variés; des composantes des parois bactériennes Gram-positive telles que l'acide lipotéichoïque (LTA), le peptidoglycane ou les lipoprotéines, le zymosan de la paroi des mycètes, les glycolipides exprimés chez certains spirochetes ainsi que les porines produites par Neisseria [105-108]. Cependant, le rôle du TLR2 ne se limite pas à la reconnaissance de la paroi des bactéries ou des mycètes alors que plusieurs virus tels que le virus respiratoire syncytial [109], le virus de l'hépatite C [110, 111] ou le virus de la rougeole [112], peuvent aussi activer le TLR2 via l'attachement de certaines protéines virales.

La raison pour laquelle le TLR2 à la capacité de reconnaître une grande variété de ligands peut s'expliquer partiellement via l'hétérodimérisation de ce récepteur avec deux autres TLRs, le TLR1 et le TLR6. Ce phénomène de reconnaissance hétérotypique augmente la spécificité des récepteurs pour une certaine classe de lipopeptide. En effet, l'hétérodimère formé du TLR1 et du TLR2 reconnaît préférentiellement des lipopeptides contenant trois groupements acylés (exemple : la molécule synthétique PamsSCKO alors que les lipopeptides diacylés seront détectés par l'association TLR2/TLR6 [113-115]. De plus, tout comme le TLR4, l'activation optimale du TLR2 peut, dans certains cas, requérir la présence du corécepteur CD 14, par contre sa participation n'est pas essentielle comme dans le cas du TLR4 [116]. De récentes études ont toutefois établi que le rôle du TLR2 ne se limitait pas à l'induction de la voie NF-KB via la reconnaissance d'un ligand à la surface de la cellule. En effet, la stimulation avec le

Figure

Figure 1: Transcription séquentielle des gènes précoce-immédiats, précoces et tardifs
Figure 2: Mécanisme de sortie proposé pour le virus Epstein-Barr.
Tableau 2: Fonctions des protéines exprimées lors de la latence d'EBV
Figure 3: Schéma de l'interaction EBV-cellule lors de la primo-infection et de la latence
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