1RS 661 EBV CpG-2116 R837 B iODN 1RS 661 EBV CpG-2116 R837 12000 EBV CpG-2116 R837
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Figure 8
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Figure 9
Fluorescence intensityChapitre 4
Discussion
La découverte des TLRs a permis une avancée majeure dans le domaine de l'immunité innée. L'interaction de ces récepteurs et de leurs ligands ont permis une meilleure compréhension de plusieurs mécanismes incompris jusqu'à ce jour. Servant principalement à la détection d'infections microbiennes, les TLRs sont responsables de l'induction des tout premiers signaux menant au déclenchement d'une réponse immunitaire. Lors de cette recherche, nous nous sommes intéressés à l'activité des TLRs dans le contexte d'une réponse pro- inflammatoire suivant une stimulation par le virus Epstein-Barr. Ce virus opportuniste est très répandu dans la population mondiale, notamment par son mode de transmission efficace, mais aussi grâce à sa particularité de pouvoir demeurer chez son hôte tout au long de la vie de celui- ci. Très peu est connu de nos jours sur le rôle précis des récepteurs de l'immunité innée contre EBV, ce qui nous a poussés à explorer plus en détail les fonctions du TLR2 et du TLR9 dans la reconnaissance de ce virus.
Nous avons démontré qu'EBV activait la production de cytokines pro-inflammatoires via l'interaction avec le TLR2. Nous avons tout d'abord effectué des essais grâce à un modèle de cellules HEK293 transfectées avec un plasmide d'expression pour le TLR2 (HEK293-TLR2), ce qui nous a permis d'établir qu'il y avait bien interaction entre EBV et ce récepteur. La gp350 représente la protéine majeure constituant l'enveloppe du virus. L'utilisation de fragment F(ab')2 d'un anticorps bloquant dirigé contre cette protéine a été suffisante pour inhiber de manière significative l'activation de NF-KB chez les cellules HEK293-TLR2. De la
même façon, un anticorps anti-TLR2 a aussi empêché l'activation du récepteur par le virus. Il est clair alors que l'interaction EBV-TLR2 est importante dans ce modèle. Par contre, nous ne pouvons affirmer que la gp350 est la protéine cible du récepteur TLR2 alors que l'effet observé pourrait avoir été causé par un phénomène d'encombrement stérique des fragments d'anticorps. Chez le CMV humain, les glycoprotéines G et H de l'enveloppe, impliquées dans l'entrée de la particule virale, sont nécessaires à l'activation du TLR2 [141]. Etant donné l'homologie entre ces glycoprotéines d'un virus herpétique à l'autre, ces deux molécules
pourraient aussi être des ligands potentiels du TLR2 à la surface du virion. Dans un contexte d'immunité innée, quelques sous-populations de cellules mononuclées du sang se distinguent par leur rôle essentiel dans ce mécanisme de détection non-spécifique ainsi que par leur habileté à lier l'immunité innée et acquise. On note parmi celles-ci les monocytes primaires qui sont rapidement recrutés au site d'infection dans les tout premiers instants de la réponse inflammatoire, contribuant aussi de manière importante à la production de cytokines/chémokines pro-inflammatoires. Ces cellules participent de plus à la présentation antigénique. La maturation des monocytes peut aboutir à la naissance de macrophages et de cellules dendritiques, ce qui leur permet de faire un pont entre l'immunité innée et adaptative. L'augmentation des transcrits de plusieurs cytokines importantes ainsi que la production de MCP-1 par le monocyte de façon dépendante du TLR2-dépendante ont confirmé qu'EBV pouvait bel et bien déclencher une réponse pro-inflammatoire via la reconnaissance du TLR2.
Le deuxième manuscrit présenté dans ce document avait pour but de déterminer si le matériel génétique du virus Epstein-Barr pouvait être reconnu par le TLR9, récepteur de l'immunité innée exprimé sur une grande variété de types cellulaires. Le TLR9 reconnaît particulièrement de l'ADN double brin étranger hautement méthylé et riche en motifs CpG Ces propriétés sont répandues notamment chez les bactéries et certains virus, comme la famille des Herpesviridae. Il est connu que plusieurs membres des virus herpétiques sont reconnus par le TLR9 [150-152, 161], mais peu d'études ont été menées sur des cellules humaines. Dans le cas présent, l'étude chez la souris est proscrite, car EBV ne peut créer d'infection productive chez la souris dû à la spécificité d'hôte très stricte des gamma-herpesvirus [155-157]. Nous avons donc utilisé des cellules extraites du sang périphérique humain, et plus spécifiquement deux types cellulaires très importants pour l'immunité innée et antivirale; les monocytes et les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Malgré le fait que le TLR9 ne soit pas exprimé en grande quantité chez le monocyte humain, il n'en reste pas moins que celui-ci est fonctionnel. L'activation du TLR9 par différentes séquences d'ODNs pousse le monocyte à produire de l'IL-6, à proliférer et à se différencier [164]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes, quant à elles, sont synonymes d'immunité antivirale par leur qualité de cellules productrices d'IFN de type 1. Faisant aussi partie de la famille des cellules présentatrices d'antigène, les pDCs sont aussi impliquées dans l'activation de l'immunité adaptative. Les résultats présentés démontrent clairement que les
monocytes et les pDCs peuvent participer à l'activation d'une réponse immunitaire efficace suite à l'infection pas EBV.
L'incubation des monocytes primaires humains avec des particules virales d'EBV pousse ces dernières à produire de 1TL-8. L'utilisation d'ADN viral purifié nous a permis d'établir la responsabilité d'un récepteur pouvant reconnaître de l'ADN double brin dans le processus de production d'IL-8. La dégradation de cet ADN par de la DNase abolit totalement son pouvoir immunogénique, démontrant la spécificité du ligand. Le TLR9 est vraisemblablement le candidat responsable de la réponse observée alors que le traitement avec de la chloroquine (CQ), agent empêchant l'acidification des endosomes, inhibe aussi la production d'IL-8 par les monocytes. Par contre, seulement une diminution partielle de la production d'IL-8 a été observée chez les cellules infectées par EBV et prétraitées avec de la CQ. Les résultats précédemment obtenus lors de l'étude de l'interaction entre EBV et le TLR2 nous ont poussés à vérifier si tout d'abord la double reconnaissance d'EBV par le TLR2 et le TLR9 était possible chez le monocyte et deuxièmement, à déterminer l'apport de chaque récepteur dans cette coopération. Il semblerait que l'apport du TLR2 et du TLR9 dans la sécrétion d'IL-8 par les monocytes semble se faire d'une manière additive. En effet, l'abolition de l'expression du TLR2 par un siRNA ou l'utilisation d'ODN inhibiteur bloque partiellement la quantité d'IL-8 synthétisée. Une combinaison des deux inhibiteurs ne provoque pas non plus l'inhibition complète de 1TL-8 mais la baisse observée est légèrement plus significative. Sato et coll. ont précédemment démontré que la reconnaissance de HSV-2 par les cellules dendritiques de souris impliquait l'activation séquentielle du TLR2 et du TLR9, et ce, afin d'obtenir production optimale de cytokines pro-inflammatoires [137]. Parallèlement, il semblerait que ce même processus soit utilisé par les monocytes en ce qui concerne EBV, le TLR2 étant en tout premier activé suivit par le TLR9 suite à l'entrée d'EBV dans la cellule. La reconnaissance initiale par le TLR2 à l'extérieur de la cellule pourrait non seulement déclencher l'initiation de la réponse immunitaire, mais aussi induire certaines modifications cellulaires, telles que l'augmentation de l'expression du TLR9, afin d'accroître la sensibilité de la cellule à la détection des composantes virales. De plus, cette double activation semble promouvoir une réponse cellulaire accrue via la production de cytokines pro-inflammatoires, ce qui pourrait assurément faciliter le contrôle de la propagation d'EBV. La coopération entre
ces deux récepteurs a aussi été étudiée dans un modèle in vivo suite à l'infection par HSV-2 de souris déficientes pour le TLR2 et le TLR9 [162]. L'étude a clairement établi que la présence des deux TLRs augmentait la résistance contre l'infection, le recrutement des cellules NK et la production de cytokines pro-inflammatoires, et ce, de manière synergique. Cependant, il faut aussi considérer que l'infection des monocytes par EBV peut stimuler la production d'IL-8 par d'autres mécanismes considérant que l'inhibition du TLR2 et du TLR9 ne bloque pas totalement la sécrétion d'IL-8 par les monocytes infectés. Les TLRs pourraient aussi par exemple être activés par des molécules endogènes [165] relarguées par les cellules nécrotiques dans le milieu extracellulaire, un programme de mort cellulaire souvent déclenché lorsqu'un trop grand nombre de cellules se retrouvent dans le même environnement. D'un autre côté, EBV peut aussi activer RIG-I, un récepteur cytosolique, via les séquences d'ARN EBERs produites par EBV [158]. Étrangement, l'infection des monocytes par le virus Epstein-Barr ne comporterait pas seulement des avantages aux systèmes de défense immunitaire. En effet, il a été démontré qu'EBV pouvait promouvoir la survie des monocytes humains, et ce, via un mécanisme inhibant l'entrée de ceux-ci en apoptose [166]. Ceci semblerait alors appuyer l'hypothèse voulant que le monocyte puisse possiblement servir de transporteur au virus. La sécrétion de chémoattractants pourrait potentiellement faciliter l'infection subséquente d'un plus grand nombre de cellules. Une étude menée par Tugizov et coll. a démontré que le monocyte servirait de transporteur au virus, facilitant ainsi le passage d'EBV à travers les différentes couches d'épithélium buccales et provoquant l'apparition de leucoplasie orale («hairy leukoplakia») caractéristique chez les patients atteints du VIH [95]. Il semblerait que l'équilibre précaire existant entre l'efficacité de la réponse immunitaire et la capacité du virus à se répliquer soit crucial pour les étapes subséquentes de l'infection par EBV, d'où l'importance de mieux comprendre les mécanismes immuns innés survenant lors de tous premiers moments de la primo-infection ou de la réactivation virale.
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes représentent un point central reliant l'immunité innée et adaptative. La présentation de peptides viraux par les cellules présentatrices d'antigène déclenche l'activation de l'immunité spécifique via l'activation des lymphocytes. Il est connu que la stimulation des pDCs par différentes séquences d'oligonucléotides peut induire préférentiellement la maturation des pDCs vers la fonction de présentation d'antigène via
l'augmentation de l'expression de plusieurs molécules de costimulation. D'un autre côté, certaines séquences poussent les pDCs vers une production massive d'interféron de type 1, délaissant la voie de differentiation cellulaire [167]. Nous avons présenté ici que la stimulation des pDCs pouvait à la fois induire la maturation de la cellule, mais aussi la sécrétion d'IFN-a. Le virus Epstein-Barr induit une augmentation significative de l'expression du CD40 et du CD86, deux récepteurs impliqués dans la présentation antigénique. Il est donc clair que, face à une infection virale, les pDCs sont programmées pour soutenir de manière efficace l'activation de la réponse acquise. D'autre part, suite à la même stimulation par EBV, ces cellules ont aussi la capacité de synthétiser une quantité impressionnante d'interféron, assurant de ce fait la réponse antivirale innée. L'activation des pDCs humains est majoritairement déclenchée via les TLRs exprimés, soit le TLR7 et le TLR9. Nous avons prouvé que chez les monocytes primaires humains, le TLR9 participe à la reconnaissance du virus Epstein-Barr, en collaboration avec le TLR2. Chez les pDCs, nous avons aussi démontré que ce même récepteur était l'acteur principal de la réponse cellulaire face à EBV, quoique l'implication d'un autre récepteur soit aussi à considérer. Il semblerait que le TLR7, un autre TLRs exprimé chez les pDCs, pourrait aussi participer à la reconnaissance d'EBV. Chez les lymphocytes B, Martin et coll. ont démontré qu'EBV pouvait augmenter la vitesse prolifération des lymphocytes B infectés via l'interaction avec le TLR7. En effet, les cellules traitées avec de 1TRS 661, un antagoniste spécifique de ce récepteur, inhibent de manière significative la prolifération des cellulaires [168]. Parallèlement, une autre étude a démontré que le TLR7 peut coopérer avec le TLR9 dans la défense contre le MCMV [163]. Les expériences ont démontré que le taux de mortalité des souris déficientes pour à la fois le TLR7 et le TLR9 était plus élevé comparativement aux animaux des souches TLR9-/-. Cependant, les auteurs ont aussi établi que le TLR9 était majoritairement responsable de la réponse antivirale observée. Le mécanisme précis par lequel le TLR7 aurait accès à de l'ARN simple brin viral n'a pas encore été décrit clairement. La participation des récepteurs cytosoliques n'est pas non plus à exclure alors qu'il a été établit que RIG-I pouvait reconnaître les ARNs double brin d'EBV lors des toutes premières étapes de l'infection et que cette interaction induit l'activation de la signalisation menant à la production d'interféron [169].
En résumé, nous avons clairement démontré que les monocytes et les pDCs pouvaient détecter plusieurs composantes virales d'EBV via différents TLRs. Cette reconnaissance peut s'exercer de multiples façons alors que l'expression des différents TLRs varie entre les types cellulaires. En effet, contrairement aux pDCs, les monocytes expriment des TLRs fonctionnels à la membrane cellulaire, telle que le TLR2, leur accordant la possibilité de détecter le milieu extracellulaire. L'accès à l'espace intracellulaire permet aussi une éventuelle activation des récepteurs comme le TLR9. En ce qui concerne la reconnaissance d'EBV, nous croyons que la reconnaissance initiale du virus par le TLR2 permet non seulement d'initier la réponse immunitaire, mais aussi de potentialiser la détection subséquente par le TLR9. Du côté des pDCs, les principaux TLRs exprimés se retrouvent dans les vésicules intracellulaires, fait peu surprenant alors que ces cellules sont médiatrices de la réponse antivirale. Nous avons aussi démontré que le TLR7 et le TLR9 étaient tous deux impliqués dans la production d'IFN-a. Les résultats illustrés dans ce manuscrit décrivent clairement que les mécanismes d'activation de la réponse innée sont médiés par plusieurs éléments synergisant afin d'obtenir une efficacité optimale face aux pathogènes.