Immobilisation des différentes isoformes sur la lame CM5

L’immobilisation d’une protéine sur une lame de type CM5 est réalisé par réaction des groupements carboxyles de la surface réactive et des groupements amino de la protéine. D’après Johnson (Johnson et al, 1991), l’immobilisation est favorisée, lorsque ces groupements sont fortement ionisés (formes carboxylate et ammonium quaternaire, respectivement), de sorte que les interactions électrostatiques entre ces groupements soient maximales et induisent de ce fait un phénomène de préconcentration sur la surface réactive qui favorise alors la réaction de couplage. Le pH de la solution tampon utilisée pour réaliser l’immobilisation est donc un facteur clé car il va influencer le degré d’ionisation des groupements carboxylate de la surface (pKa ≈ 4-5) et des fonctions amine de la protéine. L’ionisation de la protéine est liée à son point isoélectrique de la

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protéine qui dépend de sa structure propre. Celui de l’anhydrase carbonique de type II humaine a un pI de 7,13 alors que celui de l’AC II bovine est de 5,88 (Lecoeur et al, 2011). Le pH optimal choisi par J. Cannon pour immobiliser l’AC II b (pH 5), ne semble pas être le pH le plus adapté pour l’immobilisation de l’AC II h.

La première étape lors de l’immobilisation de l’AC II h sur la lame CM5 consiste donc en l’évaluation du pH optimal de la solution de protéine à immobiliser. Une procédure de « pH scouting » a été réalisée : des solutions à 45 µg.mL-1 de protéine préparées dans des solutions tampons acétate 0,01 M de pH variables (3,71 à 5,85) ont été injectées pendant 2 minutes à 20 µL.min^-1 sur la cellule 4 d’une lame CM5, sans activation préalable de la surface. Ceci permet de visualiser les interactions électrostatiques entre la protéine et la surface réactive, sans qu’il ait modification de la surface, puisque ces interactions sont réversibles.

La réponse obtenue, en RU, est mesurée après le passage de chaque solution, ce qui permet de déterminer le degré d’interaction entre la protéine et la lame en fonction du pH. Les résultats obtenus pour l’AC II h sont présentés sur la figure 63.

Figure 63 : Etude de l’influence du pH sur la quantité d’interaction électrostatique entre l’AC II h et la

lame CM5.

La réponse maximale en RU, correspondant aux interactions électrostatiques maximales entre la protéine et le dextran carboxyméthylé, est obtenue pour un pH 5,22.

-4000 1000 6000 11000 16000 0 20 40 60 80 100 120 140 hACII RU R e la ti v e R e s p o n s e Time s hACII-45uM-pH 5.8, pH 5,85 hACII-45uM-pH 5.2, pH 5,22 hACII-45uM-pH 4.7, pH 4,73 hACII-45uM-pH 4.3, pH 4,27 hACII-45uM-pH 4.1, pH 4,08 hACII-45uM-pH 3.7, pH 3,71

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Bien que les deux isoformes présentent des points isoéletriques différents, le pH optimal pour l’immobilisation est assez similaire (pH 5 pour l’AC II b et pH 5,22 pour l’AC II h). Ce qui peut être expliqué comme suit : il est connu que l’immobilisation est optimale si les interactions électrostatiques entre la protéine et les groupements carboxylates de la surface réactive sont maximales. C’est le cas lorsque la forme cationique de la protéine est prédominante et que les groupements carboxylates de la lame CM5 restent sous la forme ionisée. Si à pH 5,22, la proportion de forme cationique présente pour l’AC II h est maximale, compte tenu du ∆pI entres les deux isoformes (= 1,33), cette proportion devrait être maximale pour l’AC II b à pH 3,90 et par conséquence, l’immobilisation devrait être plus facile au pH 3,90 plutôt qu’à pH 5. Mais à pH 3,90, le pourcentage de groupements carboxylates est plus faible qu’à pH 5, et les conditions favorables aux interactions électrostatiques ne sont pas respectées. Pour cette raison, la différence des points isoélectriques (∆pI) ne peut pas être directement corrélée à la différence de pH optimal pour l’immobilisation (∆pH_{immobilisation}).

Le pH 5,22 a été sélectionné pour l’immobilisation de l’AC II h. Une solution en AC II h à 45 µg.mL-1 est préparée dans le tampon acétate à 0,01 mol.L-1 à pH 5,22 et injectée à 5 µL.min-1 pendant cinq minutes de manière à atteindre le taux d’immobilisation attendu (4500 RU). Le taux d’immobilisation obtenue est de 4460 RU.

Pour s’assurer de la répétabilité de l’immobilisation, l’AC II a été immobilisée sur trois lames CM5 différentes ; des taux d’immobilisation très proches ont été obtenus (taux d’immobilisation moyen pour l’AC II h : 4480 RU, avec un coefficient de variation inférieur à 5%).

1.1.1.2. Anhydrase carbonique IX humaine (AC IX h)

i. Etape préliminaire : « dessalage » de la solution d’AC IX

Avant d’optimiser l’immobilisation de l’AC IX sur la lame CM5, une étape d’élimination du tampon Tris contenant dans la solution commerciale est nécessaire afin d’éviter une compétition entre le Tris et la protéine lors de l’immobilisation sur la lame.

Le « dessalage » est réalisé à l’aide d’un système d’ultrafiltration par centrifugation commercialisé sous le nom d’Amicon Ultra ® par la société Millipore (Figure 64). Il s’agit de microtubes de centrifugation composés de filtres laissant passer les composés de masse moléculaire inférieure au seuil sélectionné et d’eppendorfs pouvant contenir un volume maximum de 500 µL. Compte tenu de la masse molaire de l’AC II h, des microtubes ayant un seuil de 10 kDalton ont été

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utilisés. Durant l’opération, un tube sert à collecter le filtrat et un second tube sert à récupérer l’échantillon concentré.

Figure 64 : Schéma d’un cycle de « dessalage » sur microtubes de purification utilisée pour la

purification de l’AC IX : (AMICON Ultra ® 10 kDa).

Le protocole optimisé, présenté dans la partie « materiels et méthodes », comporte deux étapes successives afin de réduire au maximum la quantité résiduelle de Tris. La protéine récupérée est ensuite diluée pour atteindre une concentration de 100 µg.mL-1.

ii. Optimisation de l’immobilisation de l’AC IX h

• Optimisation du pH d’immobilisation

Une série de solutions d’AC IX h, à une concentration constante de 45 µg.mL^-1, dans un tampon acétate 0,01 M de pH allant de 3,55 à 5,30, ont été réalisées à partir de la solution à 100 µg.mL-1d’AC IX h. Après stabilisation de la ligne de base en présence de tampon de course, les différentes solutions de protéine sont successivement injectées sur la lame pendant deux minutes à 20 µL.min^-1.

La réponse en RU, est mesurée après passage de chaque solution, ce qui permet de déterminer le degré d’affinité entre la protéine et la lame en fonction du pH. Les réponses obtenues ont montrées qu’un pH de 3,55 permet de maximiser les interactions électrostatiques entre la

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surface de dextran carboxyméthylé et les fonctions amino de l’AC IX h. L’immobilisation de l’AC IX h par liaison covalente a donc été réalisée dans un premier temps à un pH de 3,55, à un débit de 5 µL.min-1. Ainsi, après activation de la surface par passage de solutions de NHS et d’EDC pendant sept minutes, une solution d’AC IX à 45 µg.mL-1 à pH 3,55 a été mise en contact avec la cellule d’intérêt pendant sept minutes à 5 µL.min^-1. Pour finir, une solution d’éthanolamine est injectée pendant sept minutes. Un taux d’immobilisation de 1900 RU a été obtenu. Ce taux est largement inférieur au taux souhaité de 4500 RU permettant d’obtenir une réponse maximale de l’ordre de 35 RU pour les analytes étudiés. Le R_max théorique pour l’étude de l’interaction entre l’AC IX et l’AZA attendu est de 10 RU. Comme le R_max théorique est assez faible, il était intéressant d’augmenter le taux d’immobilisation de l’AC IX afin d’obtenir des réponses plus importantes lors des études d’interactions.

• Optimisation des autres paramètres expérimentaux

Afin d’obtenir un taux d’immobilisation de l’AC IX h supérieur, un essai de liaison covalente a été réalisé en faisant varier les paramètres influant le taux d’immobilisation pas à pas. Dans un premier temps, une solution d’AC IX h à une concentration de 45 µg.mL^-1 dans le tampon acétate à pH 3,55 a été injectée pendant sept minutes à un débit de 5 µL.min-1 à la température de 32°C. Une faible amélioration du taux d’immobilisation a pu être observée (2170 RU). Dans un second temps, un essai a été réalisé dans des conditions opératoires similaires, par injection d’une solution d’AC IX h plus concentrée, soit à 100 µg.mL^-1. Un taux d’immobilisation équivalent de 2300 RU a été obtenu.

En conclusion, les conditions retenues pour immobiliser au mieux l’AC IX h sur la lame CM5 sont les suivantes : une température de 32°C, une concentration d’AC IX h de 45 µg.mL-1 (afin de maximiser le taux d’immobilisation en minimisant la consommation de protéine) à un pH 3,55.

La répétabilité des immobilisations a été évaluée sur trois lames CM5 différentes ; un taux d’immobilisation moyen de 2300 RU (CV < 5%) a alors été obtenu.

5.1.1.3.Anhydrase carbonique XII h (AC XII h)

Le point isoélectrique de l’anhydrase carbonique de type XII a été évalué à 7,93 par Lecoeur et al (Lecoeur et al, 2011). Pour les mêmes raisons que précédemment, une étude de l’influence du pH sur l’amplitude des interactions électrostatiques entre la surface de dextran carboxyméthylée et l’AC XII h a été réalisée. Une série de solution à 45 µg.mL-1 d’AC XII humaine préparée dans des

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solutions tampon acétate de pH compris entre 3,5 et 6 ont été injectées pendant deux minutes à 20 µL.min-1.

Les réponses les plus élevées ont été obtenues pour les pH 5,03 et 4,50. A pH 4,50 le plateau est plus vite atteint en raison d’une cinétique d’interaction plus importante. Ce pH a donc été sélectionné pour l’immobilisation de l’AC XII h. Une solution en AC XII h à 45 µg.mL^-1 a été préparée dans le tampon acétate à 0,01 mol.L^-1 à pH 4,50, puis injectée pendant trois minutes à un débit de 5 µL.min-1. Un taux d’immobilisation moyen de 3100 RU (CV < 5 %, 3 lames différentes) a été obtenu.

5.1.2.Optimisation des conditions opératoires pour les études d’interaction