Etudes préliminaires

L’électrophorèse capillaire est une méthode séparative basée sur la migration d’espèces électriquement chargées, sous l’effet d’un champ électrique intense. Le pKa des composés étudiés étant de l’ordre de 9,5, les analytes sont donc sous la forme neutre à pH physiologique. Puisqu’en séparation chirale, il est nécessaire qu’un des deux partenaires soit chargé, l’étude utilisant des CDs neutres a été réalisée à un pH élevé permettant l’ionisation anionique du composé.

Un tampon borate a été sélectionné afin d’évaluer les qualités de séparation avec six CDs neutres, 3 natives (α-CD, β-CD et ɣ-CD) et les trois dérivées hydroxypropyles (HP-α-CD, HP-β-CD et HP-ɣ-CD) à deux concentrations (5 et 10 mM). Les conditions expérimentales utilisées sont décrites dans le tableau 34.

Capillaire en silice fondue L = 50,2 cm, l = 40 cm, D = 50 µm

Température d’analyse 25 °C

Tension appliquée 5 kV

Electrolyte de séparation tampon borate 5 mM (pH 9,5) Injection hydrodynamique Anodique 5 s, 0,5 psi

Marqueur de flux DMSO

[analyte] 28 µM (0,3% DMSO)

Longueur d’onde de détection : 201 nm

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Quelle que soit la nature de la CD ajoutée dans l’électrolyte de séparation, aucune énantioséparation n’est observée. Cependant, une interaction entre la CD et l’analyte est observée par la variation du temps de migration (figure 45).

Figure 45 : Electrophérogrammes illustrant l’interaction de la β-CD pour l’Alica 87, (A) sans CD, (B)

avec 5 mM β-CD.

La cavité de la β-CD semble être la plus appropriée pour l’inclusion de l’Alica 87 alors que les cavités de la α-CD et la ɣ-CD sont probablement respectivement trop petites et trop larges pour favoriser la complexation.

Dans un second temps, comme aucune énantioséparation n’a été obtenue avec les CDs neutres, nous avons testé la NH₂-β-CD (CD cationique) dans les mêmes conditions de pH (pH 9,5, tampon borate).

Comme décrit dans le chapitre précédent, la NH2-β-CD a tendance à s’adsorber sur le capillaire, engendrant des problèmes de répétabilité et une diminution des capacités de séparation. L’utilisation d’un « coating » cationique 5 couches nous a permis de prévenir l’adsorption de la cyclodextrine cationique (NH₂-β-CD), grâce à la force de répulsion électrostatique entre la CD et le PDADMAC.

Une gamme de concentrations de 0 à 20 mM en NH2-β-CD a été testée. Alors qu’entre 1 et 5 mM, seule une interaction est observée, à 10 mM une énantioséparation partielle est obtenue (R_s = 0,35). Une concentration de 20 mM en CD conduit à une valeur de résolution égale à 0,5, mais l’énantiorésolution reste insuffisante.

Une étude sur les variations de pH de l’électrolyte de séparation a été réalisée. Comme la CD est chargée, l’état d’ionisation du composé n’est pas un facteur limitant pour la séparation des énantiomères. L’étude de l’influence du pH a été réalisée entre 7,2 (le composé est alors 100% sous forme moléculaire) et 9,5 (50% sous forme anionique), en présence de 20 mM de NH₂-β-CD. Afin de

Minutes 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 m A U 0 5 10 15 20 (A) (B) EOF

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couvrir la gamme de pH étudiée, deux tampons ont été utilisés : le tampon borate et le tampon phosphate. Une augmentation de la résolution est observée lors de la diminution de pH, mais dans cette gamme de pH, la résolution reste insuffisante (pas de retour à la ligne de base). La meilleure résolution observée est obtenue à pH 7,4 avec un tampon phosphate de concentration égale à 67 mM (Rs = 1,04). Le pH 7,4 a donc été choisi dans le cadre de nos études d’optimisation des séparations (figure 46).

Figure 46 : Illustration de la séparation énantiomérique de l’Alica 87 à pH 7,4 en présence de 20 mM

de NH2-β-CD.

Le composé étudié étant neutre à pH 7,4, des études avec une CD anionique (HS-β-CD) ont été réalisées à 10 mM. Malgré la présence d’une interaction (ΔT_m= 1,7 min), aucune énantioséparation n’a été observée.

Ces résultats préliminaires obtenus par utilisation de CDs neutres ou chargées, montrent une incapacité à obtenir une énantioséparation satisfaisante en utilisant une seule CD (mode mono-CD). Nous nous sommes donc orientés vers un mode dual-CD (système utilisant deux cyclodextrines). Ce système de double CD (mode dual-CD) est souvent utilisé, et consiste le plus souvent en l’association d’une CD neutre et d’une CD chargée permettant l’amélioration de la résolution notamment si les deux CDs ont une influence différente sur la mobilité de l’analyte, par exemple, quand une des CDs accélère, alors que l’autre ralentit l’analyte (Lelievre et Gareil, 1997 (a) et (b) ; Garcia-Ruiz et al, 2003 ; Danel et al, 2007 ; Servais et Fillet, 2013 ).

Dans le but de déterminer les conditions optimales de la séparation de nos composés, une approche multivariée a été envisagée. En effet, cette approche permet d’optimiser les paramètres de séparation en un nombre minimum d’expériences contrairement à l’étude monovariée (modification d’un paramètre à la fois) (Liu et Kang, 2012). L’utilisation d’une approche multivariée permet d’évaluer l’importance de chaque paramètre ainsi que leur interaction. Cette approche est d’autant plus justifiée dans notre cas qu’une interaction entre les deux cyclodextrines peut être supposée. Nous avons alors choisi d’utiliser un plan composite centré (CCC) afin d’optimiser la séparation

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chirale de l’Alica 87 en mode dual-CD. Les conditions expérimentales utilisées sont présentées tableau 35.

Capillaire en silice fondue « coaté » cationique L = 50,2 cm, l = 40 cm, D = 50 µm

Température d’analyse 15-35 °C

Tension appliquée 15 kV

Electrolyte de séparation BGE : tampon phosphate 67 mM, pH 7,4 Injection hydrodynamique Cathodique 5 s, 0,5 psi

Marqueur de flux DMSO

[analyte] 28 µM (0,3 % DMSO)

Longueur d’onde de détection : 201 nm

Tableau 35 : Conditions expérimentales utilisées lors des études préliminaires de la séparation de

l’Alica 87.

Avant la mise en place du plan d’expériences, une étude préliminaire a été réalisée afin de choisir les différents facteurs et de déterminer leur domaine d’étude. D’après les premiers résultats, la CD chargée (NH2-β-CD) et les CDs neutres (HP-β-CD et β-CD) ont été sélectionnées. Des interactions avec des cyclodextrines avaient été mises en évidence par les variations de temps de migration.

Des solutions contenant la NH₂-β-CD et la β-CD (ou la HP-β-CD) à différents ratios dans le BGE sont étudiées. Les valeurs de Rs obtenues pour ces différents mélanges sont indiquées dans le tableau 36. CD1 CD2 Resolution Rs NH2-β-CD (10 mM) - 0,36 NH2-β-CD (20 mM) - 1,04 NH2-β-CD (10 mM) HP-β-CD (5 mM) 0,31 NH₂-β-CD (10 mM) β-CD (5 mM) 0,95 NH₂-β-CD (20 mM) β-CD (5 mM) 1,20

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L’ajout de HP-β-CD (5 mM) dans la solution de NH2-β-CD (10 mM) entraîne une perte de résolution. Par ailleurs, l’addition de β-CD (5 mM) dans la solution de NH2-β-CD entraîne une augmentation de la résolution (R_s de 0,36 à 0,95). De plus, pour une concentration en β-CD fixée à 5 mM, une augmentation de la concentration en NH₂-β-CD a entraîné une augmentation de la résolution. La meilleure résolution a été obtenue pour un mélange de 20 mM de NH2-β-CD et de 5 mM en β-CD (Rs= 1,20).

D’après ces résultats préliminaires, la concentration en NH2-β-CD a été sélectionnée comme premier facteur (gamme de 0 à 20 mM) et la concentration en β-CD comme second facteur (gamme 0 à 10 mM) pour l’approche multivariée. De plus, plusieurs études ont démontré l’intérêt de l’addition de modificateur organique dans le tampon de séparation (Terabe et al, 1989) lors de l’optimisation de séparations chirales. En effet, l’addition de modificateur organique peut influencer plusieurs paramètres, comme l’inclusion (compétition entre le soluté et le modificateur organique), la solubilité des énantiomères, et/ou la viscosité du BGE. Trois modificateurs organiques, le méthanol, l’éthanol et l’acétonitrile ont été ajoutés dans le tampon de séparation (5%). Quelle que soit la nature du modificateur organique utilisé, une augmentation des temps de migration a été observée, et pour l’acétonitrile et l’éthanol une perte d’énantioséparation a été observée. Par conséquent, le MeOH a donc été choisi comme le troisième facteur (0-10%) du plan d’expériences.

Choix des facteurs :

Trois facteurs ont été choisis :

Concentration en NH₂-β-CD (0-20 mM) Concentration en β-CD (0-10 mM) Pourcentage de méthanol (0-10%)

Remarque :

L’effet de la température a été étudié de 15 à 35 °C (par incrément de 5 °C), une température de 15°C a conduit à la plus haute résolution et a été retenue pour le reste de l’étude. La variation du voltage appliqué a été étudiée de 5 kV à 15 kV (par incrément de 5 kV), une diminution des temps de migration associée à une faible variation de la résolution a été observée. Comme le voltage a peu d’influence sur la résolution, ce paramètre n’a pas été utilisé comme facteur du plan d’expérience. Un voltage de 15 kV a finalement été choisi, valeur pour laquelle les temps de migrations sont les plus courts.

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Les volumes injectés varient en fonction de la pression et du temps d’injection. La variation de volume injecté n’a pas d’influence significative sur la résolution de l’Alica 87. Nous avons donc décidé d’injecter un volume de 36 nL d’échantillon en appliquant une pression de 0,5 psi pendant 5 s. Ces études préliminaires ont permis de définir les conditions opératoires du plan d’expérience (tableau 37).

Capillaire en silice fondue « coaté » cationique L = 50,2 cm, l = 40 cm, D = 50 µm

Température d’analyse 15 °C

Tension appliquée 15 kV

Electrolyte de séparation BGE : tampon phosphate 67 mM, pH 7,4 Injection hydrodynamique Cathodique 5 s, 0,5 psi

Marqueur de flux DMSO

[analyte] 28 µM (0,3 % DMSO)

Longueur d’onde de détection : 201 nm

Tableau 37 : Conditions expérimentales utilisées lors de la séparation de l’Alica 87 par approche

multivariée.

Choix du plan d’expériences :

Un plan composite centré (CCC) a été choisi pour l’optimisation de la séparation des énantiomères de l’Alica 87 en mode dual CD.

Ce modèle est adapté pour évaluer l'importance de chaque facteur, pour détecter les interactions éventuelles entre les différents facteurs et pour déterminer les conditions optimales grâce à la modélisation de la surface de réponse. Un plan composite centré est composé de deux niveaux factoriels complets (codé +1, -1), d’un point au centre du domaine (codé 0) et de points en étoiles disposés symétriquement sur les axes à une distance α du centre du domaine (codé + α (-1,68), - α (1,68)). Par conséquent, le CCC est caractérisé par cinq niveaux pour chaque facteur (-α, -1, 0, +1, + α), comme illustré dans le tableau X. Le CCC a été construit à partir de huit points d'angle, six points axiaux et un point central. Chaque point est répété deux fois et huit répétitions du point central ont été effectuées afin d'évaluer la qualité de l'ajustement du modèle mathématique. Le CCC est alors composé de 36 points, 36 expériences (tableau 38). La conception du plan d’expériences a été réalisée à l’aide du logiciel MODDE ® programme expérimental statistique (version 2009, Umetrics, Malmö, Suède).

120 Niveaux [NH2-β-CD] (mM) [β-CD] (mM) %MeOH -α 0,0 0,0 0,0 -1 4,0 2,0 2,0 0 10,0 5,0 5,0 +1 16,0 8,0 8,0 +α 20,0 10,0 10,0

Tableau 38: Valeurs des différents niveaux (-α, -1, 0, +1, +α) pour chaque facteur.