La toxicité de l’ASTB a été testée sur plusieurs types de cellules. Nous avons imagé différentes cellules isolées du tissus de la grenouille en présence d’ASTB : cellules cardiaques auriculaires, fibre musculaire isolée, nœud de Ranvier du nerf sciatique. Nous n’avons pas détecté de modification morphologique entre les images en lumière incohérente en transmission et celles obtenues après coloration en TPEF.
Ce même type d’expériences n’a montré aucune variation morphologique des cellules épithéliales humaines lors d’une illumination à 800nm et avec une puissance de 15mW (figure III)C.2).
L’enregistrement des potentiels de repos et d’action du tissu auriculaire de grenouille indiquent que l’ASTB (aux concentrations de 1, 10 et 50µmol/L) n’affecte pas le potentiel de
Conclusion :
L’ASTB est donc un colorant non toxique pour l’imagerie de cellules excitables. Aux concentrations utilisées, il apparaît bien adapté pour mener des études morphologiques cellulaires puisqu’il n’induit aucune déformation.
• Photostabilité :
Au cours des expériences sur un grain de colorant nous n’avons observé aucune dégradation du signal de TPEF ou de SHG, et cela sous une illumination de 50mW au foyer ce qui correspond à une intensité de 4.104W/cm² (répartition de la puissance sur un diamètre de 400nm au foyer de l’objectif 60X) à raison de 10µs d’éclairement par pixel, et d’une exposition discontinue (20 images) de 200µs par pixel. Ces paramètres sont des majorants de ceux utilisés typiquement en imagerie cellulaire surtout en ce qui concerne la puissance incidente.
Pour les images de cellules épithéliales figure III)C.2, une exposition à une intensité de 1,2104W/cm² pour 10µs d’exposition par pixel et d’un temps total de 50µs (5 images) par pixel, ne modifie pas l’intensité du signal de TPEF. Dans les mêmes conditions, un colorant comme le RH237 (Molecular Probes) émet une intensité de SHG diminuée par un facteur 2 après 5 expositions successives.
Ceci prouve une exceptionnelle photostabilité de la molécule d’ASTB aux intensités requises en microscopie. La grande robustesse de sa structure chimique (cycles des proflavines et pont diazocine) explique ce résultat.
iv. Exemple
L’ASTB va être maintenant utilisée sur un nœud de Ranvier. Cet exemple montre la possibilité d’un suivi temporel de la déformation de cette structure après l’introduction d’une toxine.
• Déformation d’un nœud de Ranvier :
Nous proposons un exemple d’utilisation de l’ASTB comme marqueur membranaire sur un nœud de Ranvier (provenant du nerf sciatique de patte de grenouille). Il s’agit d’une zone de la fibre nerveuse où la gaine de myéline s’interrompt. Nous allons suivre la déformation de cette zone après introduction d’une toxine. Le résultat est présenté sur la figure III)C.6. L’excitation a lieu à 430nm, avec 30mW de puissance incidente.
Figure III)C.6 : Nœud de Ranvier d’un fibre nerveuse du nerf sciatique de patte de grenouille
colorée par l’ASTB 5.10-5 mol/L. TPEF (HQ535 et E700sp.) Puissance d’excitation 30mW 860nm. Echelle de longueur : 20µm.
To + 20 min To : Introduction d’une toxine
• Observations :
¾ L’ASTB a bien marqué la gaine de myéline.
¾ On remarque que la fibre nerveuse n’est pas colorée par l’ASTB.
¾ Certains points apparaissent plus lumineux, il s’agit peut-être de noyaux de cellules.
Conclusion :
L’ASTB est un marqueur membranaire très polyvalent. Il permet de colorer de nombreux types de cellules, son efficacité et sa grande stabilité en TPEF permettent des études morphologiques en microscopie non linéaire.
Nous allons proposer différentes voies d’amélioration de l’ASTB comme perspectives de ce travail expérimental.
III) D. Perspectives
Nous avons vu dans la partie C de ce chapitre, concernant les applications de l’ASTB en microscopie, que ce colorant se révélait très peu toxique, doué d’une très bonne insertion membranaire accompagné d’une excellente photostabilité. Par contre, son orientation sur la membrane est un élément défavorable pour la génération d’un signal de second harmonique. A cela il convient d’ajouter une faible efficacité intrinsèque en SHG du colorant provenant de sa structure chimique.
i.
Efficacité en SHG
L’ASTB a été synthétisée dans une but précis : former un ensemble chiral de deux chromophores interagissant par couplage excitonique. Pour viabiliser ce colorant, il faut synthétiser de nouvelles molécules sur la base de l’ASTB mais possédant une efficacité de SHG supérieure. Pour observer un signal de SHG provenant d’une membrane cellulaire, deux aspects sont à considérer : l’efficacité intrinsèque du colorant et l’efficacité d’un ensemble de molécules contenues dans le volume d’excitation. Ce dernier aspect est indissociable de son insertion membranaire et sera traité dans une seconde partie.
La faible efficacité de l’ASTB en SHG peut s’expliquer par un moment dipolaire dans l’état excité de faible valeur. Si l’on considère la structure de l’ASTB (figure III)D.1), les groupements amines et les atomes d’azotes du pont diazocine sont donneurs d’électrons (électrons du doublet libre de l’azote). L’atome d’azote de la pyridine (en jaune) est accepteur suivant les valeurs du pH. Sur chaque bras de la molécule les cycles sont plans et permettent une délocalisation des charges d’un groupement à l’autre. D’autre part, le passage de charges d’une proflavine à l’autre est impossible via le pont diazocine. En outre, ces groupements ne contribuent pas à la délocalisation d’une charge importante, il faudrait par exemple préférer à un groupement amine (NH2) un groupement nitrés (NO2), ce dernier possédant une charge
Une telle molécule n’est pas un produit commercial, chaque molécule nécessite un important travail de recherche en synthèse asymétrique qui ne répondra pas forcément à toutes nos attentes.
Un groupement nitro à la place d’un groupement amine, doit forcément modifier la réactivité du colorant vis-à-vis des composés présent dans les cellules. Rien n’indique qu’un colorant plus efficace pour le second harmonique ne sera pas un véritable poison pour la cellule (toxicité éventuelle de NO2-).
Une autre voie à explorer pour améliorer l’efficacité de ce colorant serait d’augmenter la valeur du moment dipolaire dans l’état excité, non pas en augmentant la valeur de la charge, mais en augmentant la taille du dipôle. Pour cela, une voie envisagée serait d’augmenter la distance séparant les groupes donneurs d’électrons des groupes accepteurs. Il faudrait utiliser des molécules planes (pour assurer la délocalisation) plus longues que les proflavines actuelles. Ces structures pourraient permettre, en outre, une meilleure insertion membranaire.
Figure III)D.1 : forme semi développée de l’ASTB(-), où les groupements accepteurs