Figure IV)A.4 : superposition de l’image IV)B.3.a de fluorescence et de l’image IV)B.3.b de
SHG
Nous avons également étudié d’autres coupes qui présentaient des glandes sudoripares. Pour observer ces glandes, nous utilisons un objectif 60X à immersion à eau d’ouverture 0.9, avec un rayonnement incident à 860nm de 20mW. Nous utilisons un filtre GG3 pour détecter la fluorescence rétrocollectée (associé à des filtres E700sp) et un filtre interférentiel Chroma HQ430/20 pour le signal harmonique transmis (utilisation de filtres E700sp). Le résultat de la superposition des deux images est présenté sur la figure IV)A.5.
Couche cornée
Zone d’extension des fibres oxytalanes Epiderme Derme Papille Fibres de collagène Feuillet d’élastine Fibres oxytalanes (microfibrilles isolées) Lame basale
Figure IV)A.5 : image de glandes sudoripares. Image TPEF (rouge) filtre GG3. Image SHG
(vert) venant du collagène filtre HQ430/20. Objectif 60X Olympus à eau O.N. : 0.9, excitation 860nm 20mW. Temps par pixel : 10µs.
Ces observations effectuées sur des coupes histologiques auraient pu être réalisées sur des prélèvements de peau épais. La fixation du tissu ainsi que sa découpe au microtome n’est alors plus nécessaire. Il existe donc un gain de temps et de manipulation important en utilisant conjointement la microscopie de fluorescence à deux photons et celle de SHG. Cette réunion permet d’observer la peau immédiatement après rasage et prélèvement en évitant également les étapes de fixation et de coloration nécessaires en microscopie classique. L’observation de la peau et la détection d’anomalies sont également facilitées par la reconstruction dans l’espace des images obtenues dans différents plans.
La microscopie multiphotonique se révèle donc être un outil particulièrement bien adapté pour les études histologiques effectuées sur la peau. Les nouveaux contrastes permettent d’identifier un grand nombre de structures connues (derme, épiderme, lame basale, feuillets d’élastine, collagène, glande sudoripares, etc..), avec une représentation assez proche de la vision classique.
• Cirrhose du foie :
La cirrhose hépatique est le cas le plus avancé de la fibrose. Lors d’une fibrose, l’organe cible (foie ou parenchyme pulmonaire) est envahi par des fibres de collagène. Ceci est accompagné d’une nécrose des hépatocytes. Une distorsion vasculaire en résulte ainsi qu’une régénération nodulaire des hépatocytes.
La cirrhose peut être causée par une hépatite C ou B, un alcoolisme, une déficience d’α1- antitripsine (la production d’antitripsine venant du foie est anormale, la tripsine dégrade alors les tissus), une hémochromatose (accumulation de fer), et une tyrosinémie (insuffisance d’hépatocytes d’origine génétique, problème de production de la phénylalanine) [Poynard,
1997].
• Prélèvement :
L’observation routinière de foie se fait par prélèvement d’une carotte d’un centimètre de long et de quelques millimètres d’épaisseur.
Dans le cas d’une observation en microscopie multiphotonique, seule une découpe de la biopsie en section d’un millimètre d’épaisseur est requise. Le gain de temps est considérable et les risques liés aux différentes étapes du mode opératoire sont réduits.
• Observations :
Des biopsies de foie fixées dans le formol non colorées ont été utilisées, des tranches d’un millimètre d’épaisseur sont découpées et placées dans une solution physiologique. Nous avons utilisé un objectif Zeiss Neofluar 10X à air permettant un champ de vue important (2mm). Il possède une ouverture de 0.3 permettant ainsi une résolution latérale de 1,2µm. Cet objectif a été choisi en fonction de son champ de vue, car les faisceaux de collagène s’étendent sur plusieurs millimètres.
La lumière incidente issue de l’oscillateur Ti :Saphir est réglée à 860 nm, avec une puissance moyenne incidente au foyer de 15 mW, permettant de se placer dans une zone spectrale où le signal de fluorescence et celui de SHG sont importants. Une pénétration importante dans le tissu est possible (jusqu’à 400 µm dans le foie étudié avec l’objectif précisé à 15 mW).
Le signal de fluorescence est détecté à travers 2 filtres E700sp et un filtre GG3 vers l’arrière, celui de SHG traverse deux filtres E700sp et un filtre interférentiel à 430 nm (Chroma HQ430/20) vers l’avant.
Nous identifions le collagène présent naturellement autour des vaisseaux car c’est l’émetteur de SHG présent dans le tissu (figure IV)A.6 et 7). En partant des vaisseaux, le collagène remplace les zones saines contenant des hépatocytes, il relie les vaisseaux entre eux isolant ainsi les hépatocytes (fluorescents) en nodules. Ces nodules sont absents du foie sain observé.
Nous avons utilisé un objectif Olympus Plan-Fluorite 60X à immersion à eau, d’ouverture 0.9, avec les mêmes filtres, pour visualiser la structure du foie sain. On observe les cellules tenues entre elles par le tissu conjonctif où des fibres de collagéniques sont visibles (figure IV)A.8).
Figure IV)A.6 : Image de foie cirrhosé. Les fibres de collagène relient les vaisseaux entre eux
ce qui entraîne l’apparition de nodules. Image TPEF (rouge) filtre GG3. Image SHG (vert) provenant du collagène filtre HQ430/20. Objectif 10X à air O.N. : 0.3, excitation 860nm 20mW. Temps par pixel : 10µs. Projection de 80 images espacées de 3µm (épaisseur : 240µm), intensité moyenne.
Figure IV)A.7 : Image de foie cirrhosé. Les fibres de collagène relient les vaisseaux entre eux
ce qui entraîne l’apparition de nodules. Image TPEF (rouge) filtre GG3. Image SHG (vert) provenant du collagène filtre HQ430/20. Objectif 10X à air O.N. : 0.3, excitation 860nm 20mW. Temps par pixel : 10µs. Projection de 40 images espacées de 3µm (épaisseur : 120µm), intensité moyenne.
Figure IV)A.8 : Image de foie sain. Les hépatocytes (fluorescents en rouge) sont entourés par
le tissu conjonctif comportant des fibres de collagène (en vert). Objectif 60X à air O.N. : 0.9, excitation 860nm 20mW. Taux par pixel : 100kHz. (Filtres identiques à fig.IV)A.7)
Ces images, comme les techniques microscopiques classiques, permettent d’évaluer la quantité de tissu sain remplacé par du collagène. Elles devraient ainsi permettre une classification dans l’avancée de la fibrose. Une classification existe déjà et classe l’avancée de la maladie sur une échelle de 4 niveaux. Un étalonnage serait requis pour faire correspondre l’appréciation entre la microscopie classique sur coupes fines et l’imagerie non linéaire sur coupes épaisses.
Malgré un coût important, surtout dû à la source laser, la microscopie non linéaire apparaît donc comme une technique de choix pour l’histologie. Elle permet une reconnaissance directe des structures à partir de compétences acquises en microscopie classique avec colorants. Il est donc approprié d’envisager un transfert de compétences histologiques à la microscopie multiphotonique.
A la lumière de ces deux exemples, nous pouvons développer notre argumentation démontrant les avantages de la microscopie non linéaire par rapport aux méthodes traditionnelles en histologie.