Cette technique a été introduite par Angelova [Angelova, 1986], [Angelova, 1992]. Le principe est de permettre le décollement progressif d’une bicouche à partir d’un dépôt surfacique de lipide. Un champ électrique lentement variable (entre 5 et 20Hz) est appliqué perpendiculairement au film de phospholipides.
Figure II)D.1 : principe de formation des GUVs, décollement des bicouches par application
d’un champ électrique oscillant (E).
La dernière couche est peu à peu décollée à cause des flux osmotiques électro induits à travers elle (figure II)D.1) Apparaissent à sa surface des cloques. La vésicule est formée une fois que la cloque s’est refermée sur elle-même.
• Mode opératoire
Ce mode opératoire est très largement inspiré par celui qu’Olivier Sandre a développé lors de son travail de thèse de doctorat [Sandre, 2001]. Le champ électrique transverse est créé à l’intérieur d’un condensateur plan, où chaque électrode est constituée de verre sur lequel il y a un dépôt d’oxyde d’indium dopé à l’étain (ITO pour « Indium Tin Oxide »). Ce matériau transparent permet une observation de la préparation durant la synthèse à l’aide d’un microscope. Chaque plaque rectangulaire (80X50mm) se voit fixer un câble multibrins
E
Solution du bain extérieur pénètrant entre les feuillets
(figure II) D.2.2.). Le conducteur est plaqué sur l’électrode, on le fixe grâce à de la laque d’argent qui assure un bon contact entre la plaque et le câble en pénétrant entre les brins par capillarité. Il faut veiller à ne déposer pas de laque en dehors de la zone de recouvrement entre le câble et à l’électrode Le montage est immobilisé jusqu’à séchage de la laque argentée durant plusieurs heures, puis toute partie contenant de la laque est recouverte de colle époxy, qui consolidera le montage. Un jour de séchage est alors requis.
• Sur une zone limitée circulaire de l’électrode, le lipide initialement solubilisé dans un mélange 2/3 chloroforme 1/3 méthanol est déposé. Ce mélange s’évapore plus lentement que le chloroforme seul et permet un étalement supérieur sur l’électrode. • Les deux électrodes sont placées sous vide durant une à plusieurs heures afin
d’évaporer toute trace de solvant.
• Un espaceur en téflon (45X45mm), d’épaisseur variable (entre 0.5 et 1mm), est placé sur une première électrode (voir figure II) D.2). Il possède un orifice circulaire correspondant à la zone de dépôt du lipide sur l’électrode, et un petit canal permettant le passage d’une aiguille.
• Un long et fin cordon de Critoseal (pâte inerte chimiquement) est disposé le long du périmètre rectangulaire de l’espaceur qui doit être en tout point plus épais que l’espaceur. On superpose alors la seconde électrode en comprimant le cordon pour assurer une étanchéité de la chambre contenant le lipide.
• Un champ électrique sinusoïdal est appliqué (tension entre électrodes de 0.5Veff entre 6 et 15Hz, la fréquence est de 6Hz pour l’eau pure et de 15Hz pour une solution trente fois plus visqueuse), on perce le cordon de Critoseal qui conduit au canal présent dans l’espaceur avec une aiguille.
• Une nouvelle aiguille est utilisée avec une seringue contenant la solution de gonflement. Le remplissage de la chambre se fait très lentement et doit être effectué en excès afin de supprimer les éventuelles bulles d’air présentes dans la chambre. De la Critoseal est étalée au niveau de l’orifice grâce à une spatule pour assurer l’étanchéité de l’ensemble.
• Toutes les 10minutes, la tension est augmentée de 0.2Veff pour atteindre 1.2Veff. Le montage reste ensuite une à six heures à cette tension (plus le mélange est visqueux et plus le temps est long). Pour finir, la tension est amenée à 1.3Veff à basse fréquence (4Hz) pour détacher des vésicules de la surface des électrodes. Il ne faut pas dépasser cette tension afin d’éviter l’électrolyse de l’eau ou la destruction des électrodes.
• Un perçage du conduit est à nouveau réalisé avec une première aiguille, puis une seconde est utilisée pour les récupérer, celle-ci possédant un diamètre intérieur le plus grand possible pour permettre le passage des vésicules. Si le diamètre extérieur des aiguilles est trop gros, elle sépare les deux électrodes et la solution contenant les GUVs se répand. La solution contenant les GUVS peut alors être conservée plusieurs mois à 4°C.
Figure II)D.2 : vue de haut de cellule d’électroformation.
On utilise une solution de gonflement contenant 100mmol.L-1 de sucrose dans de l’eau distillée. Si les GUVs doivent être conservées longtemps, il est possible d’ajouter une trace d’azide de sodium (Na+N3-) à la concentration approximative d’1µmol.L-1 à la solution de
gonflement avant la synthèse. L’azide est ajouté pour éviter toute prolifération bactérienne dans le milieu (le sucre étant un nutriment des bactéries).
Il est aussi possible d’inclure des ions dans la solution de gonflement. Il faut alors travailler avec un espaceur plus fin pour conserver la même limite de différence de potentiels en évitant l’électrolyse de l’eau (1,0V à pH=7) et en bénéficiant alors d’un champ électrique oscillant plus intense (E=∆V/d, où ∆V est la différence de potentiel entre les deux électrodes espacées de d). Notons, que l’on dépasse souvent cette valeur
Chambre contenant les lipides déposés sur chaque électrode Espaceur en Téflon Cordon de Critoseal Canal permettant le passage d’une aiguille
aux maxima du signal (1,7V crête), mais pour des raisons cinétiques l’électrolyse de l’eau n’a pas lieu si la tension ne dépasse pas trop longtemps 1,0V.
Cette augmentation du champ est nécessaire pour essayer de réduire l’écrantage dû aux ions libres dans la solution. Nous avons pu synthétiser des vésicules unilamellaires d’un diamètre de 20µm contenant 5mmol.L-1 de chlorure de potassium (K+,Cl-) et 50mmol.L-1 de sucrose.
La solution contient toujours un peu de vésicules multilamellaires, mais la plupart sont unilamellaires. Leur taille peut aller jusqu’à 50µm de diamètre pour une solution de sucrose de 50mmol.L-1. De façon générale, il faut diminuer la concentration de sucre pour obtenir des vésicules plus grosses, mais elles sont alors plus fragiles.