CHAPITRE 5 – MATERIELS ET METHODES
2.9 D IFFUSION DE LA LUMIERE (DLS)
La taille et la polydispersité (PDI) des LNP ont été mesurées par la technique de diffusion de la lumière (DLS) par le Zeta Sizer Nano ZS de Malvern Instrument à 25 °C dans des cuvettes jetables Kartell.
2.10 S
PECTROPHOTOMETRIEUV-V
ISLes mesures d’absorption des solutions ont été réalisées avec un spectrophotomètre UV-Vis Varian Cary 300 sur des échantillons de 1 mL de solution dans des cuves quartz. La référence utilisée est une cuve identique contenant le même solvant. La quantification du naproxène (NAP) a été effectuée à la longueur d’onde λ = 272 nm qui correspond à un des maxima d’absorption de la molécule (voir spectre en Figure 5-1a), après réalisation d’une courbe d’étalonnage de 10 solutions étalons (Figure 5-1b).
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Figure 5-1 : a) Spectre d’absorbance du NAP (à 15 mg.L-1 dans l’eau) et b) courbe d’étalonnage du NAP
2.11 F
LUORIMETRIEL’émission des LNP en solution a été étudiée à l’aide du spectrofluorimètre Perkin Elmer LS50B. Les spectres d’émission ont été mesurés entre 400 et 800 nm avec une vitesse de 500 nm.min-1 et des fentes d’excitation et d’émission réglées à 10 nm. Les longueurs d’onde d’excitation utilisées sont les mêmes que celles du scanner en fluorescence.
2.12 R
HEOLOGIEL’étude rhéologique a été effectuée sur un rhéomètre Anton Paar MCR 502 ou sur un rhéomètre Malvern Kinexus pro + équipés de systèmes cône-plan de diamètre 50 mm et d’angle 1° pour le premier et de diamètre 40 mm et d’angle 4° pour le second.
Les mesures de viscosité des solutions electrospinnées ont été réalisées à une température constante de 25 °C et pour des taux de cisaillement compris entre 1 et 100 s-1 (20 points par décade).
Le suivi de la réaction de réticulation des solutions HA-PVA-HPβCD + EDC-NHS a été effectué en mode oscillatoire en mesurant l’augmentation de la viscosité au cours du temps. Un premier balayage en déformation de 0,1 à 50 % a été réalisé pour des fréquences angulaires de 1 ou 10 rad.s-1 afin de s’assurer de la réponse linéaire du fluide dans les conditions de mesures choisies. La déformation et la fréquence angulaire ont ainsi été respectivement fixées à 10 % et 10 rad.s-1 et la viscosité de la solution a été mesurée 30 min après l’ajout de l’EDC et du NHS pendant une durée de 4 h.
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Afin de mesurer la concentration d’enchevêtrement de nos mélanges, 19 solutions de HA-PVA-HPβCD de concentrations totales en solides variant entre 0,18 et 29,3 % w/wH2O mais de ratio massique fixe de 6-6-10 ont été préparées. Leur viscosité a été mesurée à 25 °C entre 1 et 100 s-1 et la viscosité spécifique (ηsp) de chaque mélange a été calculée en utilisant la formule suivante :
89: =8 − 88 %
%
Avec η la viscosité de la solution et η0 la viscosité de l’eau à 25 °C soit 0,89 mPa.s.
Les viscosités spécifiques obtenues ont ensuite été tracées en fonction de la concentration totale en solide.
2.13 R
ESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE(RMN)
Des spectres RMN du proton ont été exécutés à l’aide d’un spectromètre Avance III HD 400 MHz. Tous les solides étudiés ont été solubilisés à température ambiante pendant 3 h minimum dans du D2O, à des concentrations de 10 mg.mL-1. Les spectres ont été réalisés à une température de 298 Ket à partir de 64 scans.
2.14 C
HROMATOGRAPHIE D’
EXCLUSION STERIQUE(SEC)
La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) a été utilisée pour déterminer avec précision la masse molaire en poids (Mw) de l’acide hyaluronique (HA). Elle a été réalisée à l’aide d’un instrument de chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) Shimadzu équipé d'une colonne d'exclusion TOSOH TSK gel SuperMultipore avec une colonne de garde du même matériau et une boucle d'échantillonnage de 100 μL. Les pics d'élution ont été mesurés avec un détecteur d'absorbance UV-VIS, ainsi qu’un détecteur multi angulaire à diffusion de la lumière Wyatt Dawn Helios (MALS) associé au réfractomètre différentiel Wyatt Optilab rEX (dRI). Le tampon d’élution utilisé pour la HPLC est composé de 0,1 mol.L-1 NaNO3 + 0,01 mol.L-1 PB (tampon sulfate sans sel) à pH 7. Le débit a été fixé à 0,6 ml.min-1 et toutes les mesures ont été réalisées à température ambiante (21 °C). Avant la mesure, l'échantillon a été solubilisé dans le tampon d'élution à une concentration de 10 mg.mL-1 puis dilué 10
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fois. Trois injections répétées ont été effectuées à la concentration finale de 1 mg.mL-1. Le dn/dc utilisé pour calculer le poids moléculaire a été mesuré en mode batch (injection des liquides directement dans le détecteur)à l’aide du logiciel Astra 6.1, en réalisant une courbe d'étalonnage comprenant 5 concentrations comprises entre 0,1 et 1 mg.mL-1. Trois réplicas ont été effectués, permettant d’obtenir la valeur dn/dc de 0,1426 mL.g-1. Les valeurs de masse molaire en poids (Mw) et la dispersité ont été calculées en utilisant le logiciel Astra 6.1.
2.15 S
PECTROMETRIE DE MASSEMALDI-TOF
La distribution en masse de la HPβCD a été déterminée par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight) en mode positif assisté par un réflectron à l’aide d’un spectromètre de masse Microflex (Brucker). 1 mg de HPβCD a été solubilisé dans 0,5 mL d’eau Milli-Q. Une solution de matrice a été préparée en solubilisant 5 mg d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque dans 0,5 mL d’un mélange eau:acétonitrile de ratio volumique 1:1. 1 µL de la solution de matrice et 1 µL de la solution de HPβCD ont ensuite été déposés sur une cible en acier inoxydable MALDI et le tout a été laissé à température ambiante (21 °C) jusqu’à évaporation complète des solvants. L’ionisation du solide a ensuite été réalisée par un laser N2 de 337 nm et les composés formés ont été accélérés par une tension de 20 kV. Les valeurs de masse calculées ont été obtenues avec le logiciel FlexAnalysis.
2.16 E
SSAIS DE TRACTIONDes essais de traction ont été réalisés à l’aide d’un rhéomètre TA Instruments Discovery DHR 3 équipé de géométries de traction linéaires dédiées à la caractérisation des films. Des échantillons rectangulaires de 5 mm de largeur, de 22 mm de longueur et de 100 μm d’épaisseur environ ont été découpés dans de grands échantillons et ont été fixés dans les mors (voir illustration en Figure 5-2).
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Figure 5-2 : Images d’un échantillon de membrane lors d’un essai de traction avant (à gauche) et après rupture (à droite)
L'épaisseur de chaque échantillon a été mesurée par observation au MEB de chaque section transversale. La longueur initiale de l'échantillon entre les mors a été fixée à 10 mm, la vitesse de traction a été fixée à 50 µm.s-1, à une température de 21 °C. Afin de caractériser les membranes à l'état humide, les échantillons ont été d'abord fixés dans les pinces à l'état sec, puis hydratés par de l'eau distillée avant le début de l'essai de traction.
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CARACTERISATION DES COMPOSANTS
Dans un premier temps, avant tout travail de mise en forme des fibres, nous avons choisi de caractériser avec précision les différents produits utilisés. Les propriétés du PVA (masse molaire et degré d’hydrolyse) étant déjà communiquées par le fournisseur, il a été choisi de se focaliser sur l’HA et la HPβCD.