Identification des isolats sélectionnés

Les 35 isolats sélectionnés ont été caractérisés génétiquement. Pour ce faire, les gènes ARNr 16S des isolats ont été séquencés. Des séquences de taille différentes (de 900 à 1300 pb) ont été obtenus (Figure III.8), elles ont été ensuite alignées avec les séquences de différents genres bactériens provenant de la base de données GenBank (Tableau III.2). L’analyse des séquences d'ADNr 16S permet de classer les isolats dans sept genres bactériens différents. Cette analyse montre que 20% des isolats testés appartiennent au genre Klebsiella, 15% au genre Bacillus, 20% au genre Stenotrophomonas, 14% au Enterobacter, Serratia et

Raoultella, seulement 3% au genre Pseudomonas. La plupart d'entre eux (30) appartenant à la

Chapitre III Résultats et discussion

~ 42 ~

genre et la souche similaire existant dans les banques de données ont été construits par l’algorithme Neighbor-Joining en utilisant le logiciel MEGA 6 (Figure III.9).

Parmi les espèces identifiées, nous distinguons cinq isolats appartenant au genre

Bacillus dont quatre Bacillus megaterium et un Bacillus subtilis. Les colonies de Bacillus megaterium sur gélose nutritive sont de couleur blanche devenant jaune avec le temps, rondes,

lisses, brillantes et de taille moyenne. En outre, l’examen microscopique révèle des méga bacilles à coloration de Gram positif produisant des endospores (Figure III.1). Les colonies de Bacillus subtilis sont de couleur crème ou blanche de forme arrondi. Sous l’objectif X100, il apparaît des bacilles à coloration de Gram positif sporulés de taille variable. Le test catalase des espèces de Bacillus étudiées est positif, et oxydase négatif, ils sont tous mobiles.

Parmi les espèces identifiées appartenant au genre Enterobacter, quatre isolats ont été identifiés comme Enterobacter aerogenes, le cinquième (NHB19) n’a pas été identifié au niveau de l’espèce. Sur gélose nutritive, les colonies sont de taille moyennes brillantes, opaques (Figure III.2). Après observation microscopique, les bactéries apparaissent comme des bacilles à coloration de Gram négatif. Ils sont mobiles, avec un test de catalase positif et d’oxydase négatif.

Le nombre des isolats appartenant au genre Klebsiella est de sept. Ils ont tous été identifiés comme faisant parti de la même espèce Klebsiella oxytoca. Leurs colonies s’avèrent de taille moyenne, épaisses, opaques, de consistance visqueuse (Figure III.3). L’examen microscopique après coloration de Gram montre des petits bacilles à coloration de Gram négatif, de groupement souvent en diplobacilles. Ils sont immobiles, avec une catalase positif et une oxydase négatif.

Cinq autres isolats ont été identifiés sous le genre Raoultella. Trois parmi eux (NHA15, MHA59, MHB56) ont été caractérisés comme des bactéries appartenant à l’espèce

Raoultella planticola, les deux autres (SMA4 et MHA30), n’ont pas pu être identifiées au

niveau d’espèce. Ces derniers présentent presque les mêmes caractères phénotypiques de

Klebsiella (Figure III.4), sachant que l’espèce Klebsiella planticola a été reclassée

récemment dans le nouveau genre Raoultella (Drancourt et al., 2001).

Les cinq isolats NHA21, NHC12, NHA23, SHB93 et MHB51, ont tous été identifiés comme appartenant à l’espèce Serratia odorifera. Les colonies de cette espèce sont de petite taille, opaque et crème (Figure III.5). Sous le microscope ils apparaissent sous forme des bacilles ou coccobacilles à coloration de Gram négatif. Tous sont mobiles et à catalase positif et oxydase négatif.

Chapitre III Résultats et discussion

~ 43 ~

Sept autres isolats (NHA20A, NHA68, NHA78, NHA66, NHB9, NMA27 et NMA14) ont été classés dans le genre Stenotrophomonas. La totalité appartient à l’espèce

Stenotrophomonas maltophilia, anciennement Pseudomonas maltophilia. Ce genre a été

proposé par Palleroni et Bradbury (1993). Sur gélose nutritive, les colonies de cette espèce apparaissent comme des colonies de grande taille et de couleur crème. En vieillissant, elles deviennent marrons avec brunissement du milieu de culture (Figure III.6). L’examen microscopique révèle des bacilles assez fins de longueur moyenne, à coloration de Gram négatif.

Le seul isolat identifié sous le genre Pseudomonas était l’isolat SHA21, il a été identifié comme Pseudomonas fluorescens. C’est un petit bacille à coloration de Gram négatif, de catalase positif et oxydase positif présentant une fluorescence sur milieu King B (Figure III.7).

Figure III.1. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) des isolats de Bacillus.

A, B : MHA24 Bacillus megaterium, C, D : Bacillus subtilis. A

C

B

Chapitre III Résultats et discussion

~ 44 ~

Figure III.2. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

BHA62 : Enterobacter aerogenes. A : examen microscopique B: examen macroscopique.

Figure III.3. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

MHC54 : Klebsiella oxytoca.

A : examen microscopique B: examen macroscopique.

Figure III.4. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

MHB56 : Raoultella planticola.

A : examen microscopique B: examen macroscopique. B

A

A B

Chapitre III Résultats et discussion

~ 45 ~

Figure III.5. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

NHA23 : Serratia odorifera

A : examen microscopique B: examen macroscopique

Figure III.6. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

NHB9 : Stenotrophomonas maltophilia

A : examen microscopique B: examen macroscopique

Figure III.7. Examen macroscopique et microscopique (objectif 100X) de l’isolat

SHA21 : Pseudomonas fluorescens.

A : examen microscopique B: fluorescence sur milieu King B.

A B

A B

Chapitre III Résultats et discussion

~ 46 ~

Figure III.8. Electrophorèse sur gel d’agarose des résultats de l’amplification du gène ARNr

16S de différents isolats.

A :Marqueur1Kb, B: Isolates: 1-7, C: Isolates: 8-14, D: Isolates: 15-21, E : Isolates: 22-28, F : Isolates: 29 -35.

B C

D E _F

A

1,5 Kb

Chapitre III Résultats et discussion

~ 47 ~

Tableau III.2. Caractères biochimique, morphologique et génotypique des isolats.

N° Isolat Coloration

de gram Forme Ox Mob cata

Genre et espèce (séquence ADNr 16S)

1 NHA13 +ve Bacille -ve +ve +ve Bacillus megathérium 2 MHA24 +ve Bacille -ve +ve +ve Bacillus megaterium 3 BHA10 +ve Bacille -ve +ve +ve Bacillus megaterium 4 BHA0 +ve Bacille -ve +ve +ve Bacillus megaterium 5 NHA19 +ve Bacille -ve +ve +ve Bacillus subtilis 6 NHA79 -ve Bacille -ve +ve +ve Enterobacter aerogenes 7 NMB8 -ve Bacille -ve +ve +ve Enterobacter aerogenes 8 NHA67 -ve Bacille -ve +ve +ve Enterobacter aerogenes 9 BHA62 -ve Bacille -ve +ve +ve Enterobacter aerogenes 10 SHB91 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 11 SHB54 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 12 MHB62 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 13 MHC9 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 14 MHC54 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 15 MHB52 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 16 SHB57 -ve Bacille -ve -ve +ve Klebsiella oxytoca 17 NHA21 -ve Bacille -ve +ve +ve Serratia odorifera 18 SHA21 -ve Bacille -ve +ve +ve Pseudomonas fluorescens 19 NHA15 -ve Bacille -ve -ve +ve Raoultella planticola 20 MHA59 -ve Bacille -ve -ve +ve Raoultella planticola 21 MHB56 -ve Bacille -ve -ve +ve Raoultella planticola

22 SMA4 -ve Bacille -ve -ve +ve Raoultella sp

23 MHA30 -ve Bacille -ve -ve +ve Raoultella sp

24 NHC12 -ve Bacille -ve +ve +ve Serratia odorifera 25 NHA23 -ve Bacille -ve +ve +ve Serratia odorifera 26 SHB93 -ve Bacille -ve +ve +ve Serratia odorifera 27 MHB51 -ve Bacille -ve +ve +ve Serratia odorifera 28 NHA20A -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 29 NHA68 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 30 NHA78 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 31 NHA66 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 32 NHB9 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 33 NMA27 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 34 NMA14 -ve Bacille +ve +ve +ve Stenotrophomonas maltophilia 35 NHB19 -ve Bacille -ve +ve +ve Enterobacter sp +ve: positive , -ve: negative , cata: test catalase, ox: test oxidase, Mob: mobilité

Chapitre III Résultats et discussion

~ 48 ~

Figure III.9. Relations phylogénétiques entre isolats du même genre et une séquence du

Genbank basés sur la séquence de l'ADNr 16S. Les relations phylogénétiques entre les isolats du genre :

A : Bacillus et une séquence de la souche Bacillus megaterium ATCC14581 obtenu du Genbank. B :Enterobacter et une séquence de la souche Enterobacter aerogenes ATCC13408 obtenu du Genbank.

C : Klebsiella et une séquence de la soucheKlebsiella oxytoca ATCC13182 obtenu du Genbank.

D : Raoultella et une séquence de la souche Raoultella planticola ATCC_21609 obtenu du Genbank. E : Serratia et une séquence de la souche Serratia odorifera ATCC33077T obtenu du Genbank.

F : Stenotrophomonas et une séquence de la soucheStenotrophomonas maltophilia ATCC13637 obtenu du Genbank.

G : Pseudomonas et deux séquences de deux souches Pseudomonas fluorescens SCAM BA 1 et Pseudomonas fluorescens

SCAM BA obtenus du Genbank.

NHB19:Enterobacter_sp NMB8:Enterobacter_aerogenes BHA62:Enterobacter_aerogenes NHA67:Enterobacter_aerogenes NHA79:Enterobacter_aerogenes Enterobacter_aerogenes_ATCC13408 NHA15:Raoultella_planticola SMA4:Raoultella_sp MHA59:Raoultella_planticola MHA30:Raoultella_sp MHB56:Raoultella_planticola Raoultella_planticola_ATCC_21609 NMA14:Stenotrophomonas_maltophilia NHB9:Stenotrophomonas_maltophilia NHA20A:Stenotrophomonas_maltophilia NMA27:Stenotrophomonas_maltophilia NHA78:Stenotrophomonas_maltophilia NHA68:Stenotrophomonas_maltophilia NHA66:Stenotrophomonas_maltophilia Stenotrophomonas_maltophilia_ATCC13637 NHA19:Bacillus_subtilis BHA10:Bacillus_megaterium MHA24:Bacillus_megaterium BHA0:Bacillus_megaterium NHA13:Bacillus_megaterium Bacillus_megaterium_ATCC14581 MHC54:Klebsiella_oxytoca SHB57:Klebsiella_oxytoca MHB62:Klebsiella_oxytoca SHB54:Klebsiella_oxytoca MHB52:Klebsiella_oxytoca MHC9:Klebsiella_oxytoca SHB91:Klebsiella_oxytoca Klebsiella_oxytoca_ATCC13182 NHA21:Serratia_odorifera NHC12:Serratia_odorifera MHB51:Serratia_odorifera NHA23:Serratia_odorifera SHB93:Serratia_odorifera Serratia_odorifera_ATCC33077T Pseudomonas_fluorescens_SCAM_BA Pseudomonas_fluorescens_SCAM_BA_1 SHA21:Pseudomonas_fluorescens A F E C D B G

Chapitre III Résultats et discussion

~ 49 ~