Chapitre II. Materiel et méthodes
II.3. Caractérisation in vitro des isolats pour la promotion de la croissance des plantes
Cette partie de notre étude est consacrée à la caractérisation des activités des rhizobactéries isolées liées à leur pouvoir promotionnel de la croissance des plantes. Tous les tests ont été effectués en trois répétitions.
II.3.1. Mesure de l’activité de la nitrogénase
L'activité de la nitrogénase a été déterminée par le test de réduction de l'acétylène au laboratoire de contrôle génétique de la symbiose à l’institut des sciences des plantes (IPS2), Université de Paris Sud, France.
Selon la méthode de Koch et Evans (1966) modifié par Berrabah et al., (2014), chacun des isolats a été cultivé sur milieu semi solide exempt d’azote dans des viales stériles de 20 ml contenant 12 ml de milieu. Les cultures ont été incubées à 28± 2 °C sans agitation pour permettre la formation des pellicules. Après 4 jours d'incubation, 500 µl d'acétylène ont été injectés et l'incubation a été poursuivie pendant 12 h dans les mêmes conditions. La présence de l'éthylène a été détectée en utilisant le chromatographe en phase gazeuse 7820A de Agilent
Technologies (Santa Clara, USA) équipé d'un détecteur d'ionisation à flamme et d'une colonne
GS-Alumina (50 m x 0,53 mm) avec l'hydrogène comme gaz vecteur. La température de la colonne et le débit de gaz sont : 120 °C et de 7,5 ml/min respectivement.
II.3.2. Production de l’acide indole acétique (AIA)
L’analyse quantitative (dosage colorimétrique) de la production de l’acide indole acétique a été effectuée suivant la méthode décrite par Loper et Schroth (1986). Le milieu de culture correspondant additionné de 100 mg/l de tryptophane et 1 g/l de NH4Cl a été
ensemencé par 1 ml de la culture bactérienne (DO620 = 0,8) de chaque isolat. Après incubation
à 28± 2 °C pendant 96 h dans l’obscurité dans une étuve agitée à 180 tr/min , 5ml de la culture ont été centrifugés à 6000 tr/min pendant 20 min, 1 ml du surnageant a été additionné de 2 gouttes d’acide ortho-phosphorique et 2 ml du réactif de Salkowski (50 ml d’acide perchlorique à 35 % + 1 ml de FeCl3 à 0.5 M).
Après 30 min d’incubation à température ambiante dans l’obscurité, le développement de la couleur rose indique la production de l’AIA. La densité optique a été mesurée à 530 nm (Spectrophotomètre JENWAY 6715), les concentrations de l’AIA ont été déterminées à l’aide d’une courbe d’étalonnage obtenue dans un intervalle de 0 à 100 mg/l d’AIA (Sigma-Aldrich) (Annexe IV).
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II.3.3. Solubilisation du phosphate
Le test de solubilisation du phosphate nous a permet d’évaluer la capacité des différents isolats à solubiliser le phosphate inorganique Ca3(PO4)2. Ce test a été effectué
qualitativement et quantitativement :
II.3.3.1. Evaluation qualitative sur milieu gélosé
La capacité des isolats à solubiliser le phosphate a été évaluée qualitativement en utilisant le milieu gélosé de Pikovskaya (Pikovskaya, 1948) (Annexe II). Des cultures pures de chaque isolat ont été ensemencées par piqure centrale à la surface des boites de Pétri contenant la gélose Pikovskaya. Après incubation à 28± 2 °C pendant 7 jours, l’apparition d’un halo transparent autour des colonies indique la capacité de solubilisation du phosphate par l’isolat bactérien. Les diamètres des colonies et des halos ont été mesurés, les résultats ont ensuite été exprimées en efficacité de solubilisation (ES) calculé selon Nguyen et al., (1992) en utilisant la formule suivante :
ES =diamètre de solubilisation + diamètre de croissance
diamètre de croissance X100
II.3.3.2. Evaluation quantitative en milieu liquide
L’évaluation quantitative de la solubilisation du phosphate a été réalisée en utilisant le milieu liquide NBRIP (National Botanical Research Institute’s Phosphate growth medium) (Annexe II) (Nautiyal, 1999). 50 ml de milieu de culture NBRIP ont été inoculés par 1 ml de la suspension bactérienne (DO620 = 0,8) préparée à partir de chaque isolat. Après une
incubation de 7 jours à 28± 2 °C dans une étuve agité à 180 tr/min, 5 ml de chaque culture a été centrifugée à 6000 tr/min pendant 30 min, le contenu du phosphate soluble dans le surnageant est par la suite déterminé par la méthode Spectrophotométrique de jaune de vanado-molybdate (Jackson, 1958).
Selon cette méthode, 1ml du surnageant a été ajouté à 2,5 ml de réactif Barton (Annexe V) dans une fiole de 50 ml le volume a été ensuite complété jusqu’à 50 ml avec de l’eau distillée. Après 10 minutes, la lecture de la densité optique a été effectuée à 430 nm (Spectrophotomètre JENWAY 6715). Le phosphore soluble a été calculé à partir de l’équation de régression d’après la courbe d’étalonnage (Annexe IV).
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II.3.4. Production de l’ACC désaminase
L’évaluation de l’activité de l’amino-cyclopropane carboxylate désaminase (ACC désaminase) chez les différents isolats est basée sur la capacité de ces microorganismes à utiliser l’amino-cyclopropane carboxylate (précurseur de l’éthylène) comme seul source d’azote. La méthode de Jacobson et al., (1994) a été choisie pour la réalisation de ce test.
Cinq millilitre de bouillon tryptique de soja (TSB) (Annexe II) ont été inoculés par chacun des isolats. Les cultures ont été incubées pendant 48 h à 28± 2 °C dans des conditions d'agitation (150 tr/min). Les cultures ont été diluées 10 fois dans une solution stérile de MgSO4 (1M).
Dans une plaque de micro-titration de 96 puits, des solutions ont été réparti comme suit :
150 µl du milieu DF (Annexe II) sont déposés dans chacun des puits de la plaque,
15 µl de MgSO4 (0,1 M) sont ajoutés aux lignes 3, 6, 9 et 12.
15 µl de (NH4)2 S04 (0,1 M) sont ajoutés aux lignes 2, 5, 8 et 11.
15 µl d’ACC (3mM) stérilisé par filtration sont ajouté aux lignes 1, 4, 7 et 10.
22 µl de la culture bactérienne sont ajoutés dans tous les puits,
22 µl de MgSO4 (1M) sont déposés dans les puits témoin à la place de la culture
bactérienne (Figure II.3).
La densité optique a été mesurée à 620 nm après 24, 48, 72 et 96 h avec un spectrophotomètre ELISA automatisé (LABSYSTEMS Multiskan Ex). Les valeurs de la densité optique des puits remplis par MgSO4 et ACC ont été comparées avec celles remplis par
(NH4)2SO4 pour déterminer la capacité des isolats à métaboliser l’ACC. Il est considéré
comme résultat positif (présence d’activité ACC-désaminase), tout isolat microbien ayant présenté une densité optique en présence de l’ACC proche ou égal à celle de la culture contenant le sulfate d’ammonium et supérieur aux cultures contenant le sulfate de magnésium :
Chapitre II Matériels et Méthodes ~ 34 ~ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Témoin A ACC B MgSO4 C (NH4)2 S04 D E F G H
Figure II.3. Répartition des solutions dans la plaque de micro-titration de 96 puits pour le test
de l’ACC désaminase.
II.3.5. Production des sidérophores
La capacité de l’ensemble des isolats à produire les sidérophores a été testée par leur culture sur le milieu Chrome Azurol S agar (CAS) (Schwyn et Neilands, 1987) (Annexe VI). Un prélèvement de chaque culture bactérienne a été ensemencé en surface des boites de Petri coulée préalablement par la gélose CAS. Après quatre jours d’incubation à 28± 2 °C, le virement de la couleur bleue par le développement d’un halo jaune-orange autour des colonies indique la production des sidérophores. Les diamètres des halos ont été pris comme estimations de l'intensité de la production de sidérophores.
II.3.6. Production d’ammoniac (NH3)
La mise en évidence de la production d’ammoniac par les différents isolats bactériens a été réalisée selon la méthode décrite par Cappuccino et Sherman (1992). Des cultures fraîchement cultivés ont été inoculées dans 10 ml d'eau peptonée et incubées pendant 48-72 h à 28± 2 °C. 0,5 ml du réactif de Nessler a été ajouté dans chaque tube. Le développement de la couleur marron indique un résultat positif pour la production d'ammoniac.
II.3.7. Production d’acide cyanhydrique (HCN)
La méthode de Soltani et al., (2012) a été utilisée pour tester la production de l’acide cyanhydrique (HCN), chaque isolat a été ensemencé par étalement sur la surface de la gélose nutritif additionné de 4,4 g/l de glycine, un papier filtre wattman n°1 trempé dans une solution de Na2CO3 à 2% dans l’acide picrique à 0,5% a été déposé sur le couvercle de la boite, ensuite
les boites ont été scellées avec du parafilm et incubées à 28± 2 °C pendant 4 jours. Le développement de la couleur orange-marron indique la production de l’acide cyanhydrique.
Chapitre II Matériels et Méthodes
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