Identification et quantification moléculaires par SPE-CPG/SM

Il est possible d’analyser les composés organiques de petites tailles (50-600 g/mol) de la MOD par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). Cette technique s’est développée durant la seconde moitié du XXème siècle dans la recherche et l’analyse de la MO (Lee et al. 1977; Sporsol et al. 1983). Elle fournit des informations qualitatives et

quantitatives sur la composition moléculaire de l’échantillon organique. La CPG/SM est

particulièrement adaptée pour l’analyse de composés organiques à l’état de traces (Navarro et al. 1991; Ham et al. 1993; Yrieix et al. 1996; Busetti et al. 2014).

L’injection d’échantillons aqueux n’est cependant pas possible directement avec les phases stationnaires et les sources d’ionisation traditionnellement utilisées en CPG/SM (cf. 2.3.2.2). Il est donc nécessaire de procéder à une étape d’extraction permettant de changer de solvant mais également de concentrer les échantillons pour une meilleure détection. Cette étape a été réalisée par extraction sur phase solide (Solid Phase Extraction – SPE). De ce fait, le couplage SPE-CPG/SM s’utilise pour la détection de micro-contaminants dans des échantillons aqueux (Yrieix et al. 1996; Hennion 1999), l’étude des composés aromatiques polycycliques (CAP) solubilisés issus de sédiments pollués (Jeanneau et al. 2007), ou encore de phénols dans des eaux fluviales (Takeda et

al. 2013). Cette technique est donc adaptée pour l’identification de la MOD anthropique de petite

taille issue de sols contaminés comme les CAP apolaires et polaires.

2.3.2.1 Extraction sur phase solide

Alternative à l’extraction liquide/liquide, la SPE a pour avantages la faible quantité de solvant organique nécessaire et la rapidité de mise en œuvre. Elle consiste à faire passer l’échantillon aqueux à travers une cartouche contenant un adsorbant solide. Celui-ci retient les composés d’intérêt et laisse passer la matrice initiale (eau). On récupère ensuite les analytes par élution avec un faible volume de solvant approprié, ce qui permet un enrichissement en analytes idéal pour analyser des composés à l’état de trace (Figure 2-12).

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Figure 2-12 : Principe de l'extraction sur phase solide (SPE).

Il existe de nombreux adsorbants commerciaux pour les cartouches SPE, chacun ayant des propriétés spécifiques selon l’utilisation souhaitée : silice greffée en C18, adsorbants polaires, résines échangeuses d’ions… Ces adsorbants font l’objet d’études comparatives pour évaluer leur efficacité dans des domaines spécifiques (Schwede-Thomas et al. 2005; Dittmar et al. 2008). Les cartouches SPE sélectionnées pour ces travaux de thèse sont les cartouches Oasis HLB (Waters) dont l’adsorbant est un copolymère hydrophile-lipophile, résistant à des pH compris entre 0 et 14, capable de retenir les composés à la fois apolaires et polaires (par exemple les CAP). Elles sont de ce fait parfaitement adaptées à l’analyse de la MOD issue de terres d’anciennes cokeries et usines à gaz, dont la principale contamination (le goudron de houille) est fortement aromatique et formée de composés polaires et apolaires.

Avant utilisation, il est nécessaire d’éliminer l’humidité susceptible de s’être déposée dans la cartouche durant son conditionnement par le fournisseur. Pour cela, les cartouches sont séchées par aspiration sous vide durant 10 minutes. Immédiatement après, elles doivent être conditionnées afin de les purifier et d’activer les sites d’adsorption présents sur le polymère. Pour cela, il faut les rincer avec différents solvants :

 2 rinçages de 6 mL (volume de la cartouche) au solvant d’élution qui sera utilisé dans la dernière étape – ici un mélange dichlorométhane (DCM) / éthyle acétate (80/20) – pour laver les impuretés qui pourraient être éluées ultérieurement ;

 Puis 2 rinçages de 6 mL au méthanol pour activer les fonctions du polymère et éliminer les dernières traces de solvant organique insoluble dans l’eau ;

 Puis 2 rinçages à l’eau ultrapure pour éliminer les traces de méthanol et conditionner les cartouches au solvant d’extraction (eau).

Des étalons internes (EI) sont ajoutés (cf. paragraphe 2.3.2.4) à l’échantillon (500 mL) qui est alors élué à travers la cartouche SPE conditionnée grâce à un système d’aspiration (pompe à vide). Une bouteille de sécurité est installée en fin de circuit pour préserver la pompe et pour éventuellement récupérer la matrice aqueuse de l’échantillon (Figure 2-13).

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Figure 2-13 : Montage du circuit d'extraction d'un échantillon par SPE.

Finalement, les composés d’intérêt retenus sur la phase adsorbante de la cartouche SPE sont élués par 12 mL de solvant d’élution (mélange dichlorométhane (DCM) / éthyle acétate (80/20) afin d’être analysés par CPG/SM.

2.3.2.2 Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM)

La CPG/SM est une technique analytique permettant d’étudier la composition moléculaire d’un échantillon gazeux ou liquide. Celui-ci est introduit dans l’injecteur chauffé à 300°C ce qui permet sa volatilisation. Entraînés par le gaz vecteur (ici l’hélium), les analytes de l’échantillon sont ensuite séparés selon leur affinité avec la phase stationnaire de la colonne chromatographique et selon leur volatilité, puis acheminés vers le spectromètre de masse.

Arrivés dans la source d’ionisation du spectromètre de masse, les molécules sont ionisées et fragmentées par bombardement sous un faisceau d’électrons à 70 eV. Le gaz vecteur est éliminé par pompage (le vide dans le spectromètre de masse est inférieur à 10-5 Torr). Les ions sont accélérés par un courant électrique vers l’analyseur qui les sépare suivant leur rapport masse/charge (m/z). Durant ce travail de thèse, l’analyseur utilisé est un analyseur quadripolaire constitué de deux pôles positifs et deux pôles négatifs dont la fréquence oscille très rapidement, permettant la sélection des ions selon leur rapport m/z. Ils sont ensuite acheminés jusqu’au

détecteur (généralement un multiplicateur d’électrons) dont le signal est proportionnel aux

charges des ions reçus (Figure 2-14). Cette technique analytique permet ainsi d’identifier les molécules présentes dans les échantillons par comparaison avec une bibliothèque de spectres de masse. Elle permet également la quantification des composés puisque le signal du détecteur est proportionnel à la concentration des espèces dans l’échantillon. Chaque composé quantifié fait l’objet d’un calibrage de l’appareil permettant une détermination précise de sa concentration, comprise dans une gamme s’étendant de 0,03 µg/mL à 12µg/mL.

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Figure 2-14 : Montage du couplage chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse (CPG/SM).

2.3.2.3 Méthode d’analyse

Les extraits obtenus par SPE des phases aqueuses sont évaporés sous azote puis, aussitôt la dernière goutte de solvant évaporée, re-solubilisés dans 200 µL de DCM. 100 µL sont placés dans un flacon d’analyse ; le reste est conservé au frais pour des analyses ultérieures. Les extraits obtenus par extraction au solvant organique (chloroforme ou dichlorométhane) des matrices solides sont analysés directement ou après dilution.

L’échantillon (1 µL) est injecté dans le chromatographe. L’appareil utilisé est un couplage GC-QP 2010 Plus (Shimadzu) équipé d’une colonne capillaire en silice fondue DB-5MS (60 × 0,25 mm id × 0,1 µm d’épaisseur de film). Le programme en température du four contenant la colonne CPG est le suivant : 2 min à 70°C, de 70 à 130°C à 15°C/min, de 130 à 315°C à 4°C/min, pallier à 315°C durant 25 min. Le débit d’hélium est constant à 1,40 mL/min dans la colonne.

L’analyse se fait selon deux modes : fullscan et SIM (Single Ion Monitoring). Le mode fullscan enregistre l’ensemble des ions détectés (m/z compris entre 50 et 600), permettant d’analyser l’ensemble des ions produits lors de l’ionisation et de la fragmentation des composés. Le mode SIM permet la détection de certains ions spécifiques dont les rapports m/z sont prédéterminés et sélectionnés avant l’injection. Ce mode favorise une meilleure sensibilité du détecteur, et permet d’analyser avec plus de précision certains composés. Il a été utilisé pour la quantification des CAP (cf. §2.3.2.4).

Deux types d’injection ont été utilisés : split et splitless. L’injection split consiste à diviser le flux (gaz vecteur et échantillon) acheminé vers la colonne de chromatographie de manière à diluer l’échantillon. Cette injection est utilisée pour les échantillons présentant des teneurs en composés organiques importantes (échantillons extraits au solvant) ou pour doser des composés fortement concentrés. L’injection splitless consiste à introduire la totalité de l’échantillon injecté vers la colonne de chromatographie. Cette injection est préconisée pour les échantillons faiblement concentrés (échantillons aqueux) et pour l’étude des composés à l’état de traces.

2.3.2.4 Quantification des composés organiques

Pour les échantillons aqueux, 40 µL d’étalons internes (EI – listés dans le Tableau 2-3) à 12 µg/mL sont ajoutés avant l’extraction par SPE. Ils permettent une quantification plus précise tenant compte des processus impliqués lors de la préparation des échantillons (extraction SPE, évaporation sous azote, etc.). Ces étalons internes sont des molécules absentes de

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l’environnement (les atomes d’hydrogène sont remplacés par des atomes de deutérium) mais qui sont structurellement proches des molécules analysées afin que les EI et les molécules étudiées subissent les mêmes effets de matrice. La concentration finale en EI dans les 100 µL échantillonnés pour l’analyse en CPG/SM est alors de 2,4 µg/mL.

La calibration de l’appareil a été réalisée à partir d’un mélange de CAP (HAP et CAP polaires), ceux-ci étant largement présents dans les échantillons de terres d’anciennes cokeries et usines à gaz. Les EI utilisés sont des CAP deutérés. La calibration du détecteur permet de ce fait la quantification des CAP présents dans l’échantillon.

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Tableau 2-3 : Liste des composés quantifiés et de leurs étalons internes. Les ions m/z caractéristiques de chaque composé ayant servi à la quantification sont retranscrits Les sections (séparées par des pointillés) contiennent un étalon interne en

tête et les composés quantifiés à partir de celui-ci.

Composé Abréviation m/z caractéristique

[2H8]naphthalène 136 Naphtalène Na 128 [2H7]quinoline 136 Quinoline Qui 129 [2H10]acénaphthène 164 Acénaphtylène Acy 152 Acénaphtène Acé 153 [2H10]fluorène 176 Fluorène Fl 166 Dibenzofurane DBF 168 [2H10]phénanthrène 188 Phénanthrène Phé 178 Benzo[h]quinoline B[h]Q 179 Carbazole Car 167 [2H10]anthracène 188 Anthracène Ant 178 [2H8]anthraquinone 216 Acridine Ac 179 9H-fluorénone Flone 180 Périnaphténone Prone 152 Anthraquinone Aone 208 Cyclopenta[def]phénanthrone CP[def]Pone 204 Méthylanthracène-9,10-dione MAone 165 Benzo[a]fluorénone B[a]Fone 230 Benzanthrone BAone 230 Benzoanthracènedione BAdione 258 Naphtacène-5,12-dione Ndione 258 Benzo[cd]pyrènone B[cd]Pone 254 [2H10]fluoranthène 212 Fluoranthène Flu 202 [2H10]pyrène 212 Pyrène Pyr 202 Benzo[a]anthracène B[a]A 228 Benzo[a]pyrène B[a]P 252 [2H2]chrysène 240 Chrysène Chr 228 Benzo[b]fluoranthène B[b]F 252 Benzo[k]fluoranthène B[k]F 252 [2H12]pérylène 264 Indéno[1,2,3-cd]pyrène Ind 276 Dibenzo[ah]anthracène DB[ah]A 278 [2H12]benzo[ghi]pérylène 288 Benzo[ghi]pérylène B[ghi]P 276

Pour les échantillons de MO extraits au solvant organique, les CAP et leurs EI sont les mêmes que pour les échantillons aqueux. 20 µL d’EI à 12 µg/mL sont ajoutés à la MO extraite (80 µL) juste avant d’être injectés en CPG/SM.

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