Hybridation in situ couplé à l’immunomarquage

1. Hybridation in situ

Les morceaux sont inclus et congelés en OCT sont coupés à -20°C avec une épaisseur de 12 µm sur des lames SuperFrost® Plus (Menzel-Gläser) à l’aide d’un cryotome et sont ensuite fixées 20 minutes dans du formol froid 4% tamponné (Labonord). Les lames sont ensuite rincées 3 fois 5 minutes en PBS1X traité avec 0.1% de diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma Aldrich) puis acétylées deux fois 5 minutes (afin d’enlever les radicaux libres pouvant se fixer à l’ARN) dans une solution de triéthanolamine 0,1 M, pH 8,0 (Sigma Aldrich) contenant 0,25% d’acide acétique anhydre (Sigma Aldrich) ajouté extemporanément. Les lames sont ensuite rincées 2 fois 5 minutes en PBS1X/DEPC.

L’étape de pré-hybridation est réalisée dans un four à hybridation et les lames sont placées dans une chambre humide. Les coupes sont incubées 1 heure à 58°C avec du tampon d’hybridation (préalablement décrit) auquel est ajouté 1mg/mL d’ADN de sperme de saumon (invitrogen) préalablement soniqué durant 45 secondes et dénaturé (chauffé 2 heures à 95°C puis placé immédiatement dans la glace).

L’étape d’hybridation est également réalisée dans un four à hybridation et les lames sont placées dans une chambre humide. Le tampon d’hybridation additionné de 1mg/mL d’ADN de sperme de saumon et d’une des 4 sondes à une concentration de 2ng/µL est préalablement dénaturé 5 minutes à 80°C, placé 1 minute dans la glace, avant d’être déposé sur les coupes.

Environ 30µL de tampon d’hybridation + sonde sont déposés par coupe, puis chaque coupe est recouverte d’une lamelle scellée avec du Rubber Cement (Sanford) et est incubée trois jours à 58°C.

A la fin de l’étape d’hybridation, les lamelles sont retirées et les coupes subissent des lavages de stringence croissante, un premier lavage de 15 minutes en SSC 5X à 58°C puis 2 lavages successifs de 30 minutes en SSC 0,2X toujours à 58°C.

Les coupes sont ensuite incubées 30 minutes à température ambiante dans un tampon de saturation contenant du PBS1X additionné de 0,1% de BSA et de 2% de sérum normal de chèvre, pour bloquer les sites non spécifiques, avant d’être incubées 2 heures avec 100 µL de tampon de saturation contenant 0,75 Unité d’un anticorps de mouton anti-DIG couplé à la phosphatase alcaline (Roche Applied Science) en chambre humide à température ambiante. Après 2 lavages de 5 minutes en PBS1X, les coupes sont rincées 5 minutes en Tris-HCl 0,1M, pH 9,5. Les coupes sont révélées après incubation sur la nuit, à température ambiante, en chambre humide et à l’abri de la lumière avec un substrat de la phosphatase alcaline, le NBT/BCIP (Nitroblue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, Roche Applied Science) en tampon 0,1M Tris pH 9,5, MgCl2 0,05M, NaCl 0,1M, selon les recommandations

du fabricant. La réaction est stoppée le lendemain en rinçant les coupes 3 fois 5 minutes en PBS1X. Les coupes sont ensuite baignées 30 minutes dans de l’éthanol à 95% ce qui permet de fixer le marquage spécifique. La réaction de la phosphatase alcaline avec le NBT/BCIP donne un précipité de coloration bleue/violette.

2. Marquage immunohistochimique

Finalement, les coupes sont à nouveau saturées 30 minutes à température ambiante dans du PBS1X additionné de 0,5% de BSA et de 2% de sérum normal de chèvre (tampon de saturation), avant d’être incubées 1 heures avec l’anticorps anti-HLA-DR (Clone TAL.1B5, Abcam) dilué en tampon de saturation en chambre humide à température ambiante. Après 3 lavages de 5 minutes en PBS1X, les coupes sont incubées 30 minutes, toujours en chambre humide, avec une goutte par coupe du Kit ImmPRESS™ (Vector Laboratories), qui contient un anti-IgG de souris couplé à la Peroxydase. Après 3 lavages de 5 minutes en PBS1X, la révélation s’effectue en en incubant les coupes à température ambiante, en chambre humide et à l’abri de la lumière en utilisant le Kit ImmPACT™ AEC (Vector Laboratories), selon les recommandations du fabricant. La réaction est stoppée en rinçant les coupes en eau distillée. La réaction de la peroxydase avec l’AEC donne un précipité de coloration rouge.

Après plusieurs lavages dans de l’eau distillée, les lames sont déshydratées dans trois bains successifs d’alcool absolu puis trois bains d’histosol (environ une minute par bain). Les lames sont ensuite montées avec un milieu de montage non aqueux, le Vectamount (Vector Laboratories), pour observation au microscope.

V. Immunomarquage des coupes d’iléons en fluorescence et

analyse des images

A. Immunomarquage

Les morceaux d’iléon inclus et congelés en OCT sont coupés à -20°C à l’aide d’un cryotome. Des coupes sériées d’une épaisseur de 7µm sont réalisées. Puis ces coupes sont positionnées sur des lames SuperFrost® Plus (Menzel-Gläser). Après séchage des lames sur la nuit à température ambiante, les coupes sont fixées en PBS1X/paraformaldéhyde 2% 20 minutes à 4°C. Les coupes sont ensuite rincées en PBS1X et incubées 30 minutes à température ambiante dans un tampon de saturation contenant du PBS1X additionné de 5% de BSA et de 2% de sérum normal de chèvre. Les biotines endogènes sont alors bloquées à l’aide du Streptavidin/Biotin Blocking Kit (Vector Laboratories) selon les recommandations du fabricant. Les coupes sont ensuite incubées avec les différents anticorps primaires (Tableau 6) dilués dans du tampon de saturation supplémenté de 0,01% Tween20 en chambre humide sur la nuit à 4°C.

Anticorps Isotype Clone Fournisseur Concentration

d’utilisation (μg/mL)

α-CD3 IgG de lapin (polyclonal) DAKO 2,5

α-CD4 IgG1 de souris L200 BD Biosciences 5

α-CD8 IgG1 de souris RPA-T8 BD Biosciences 5

α-HLA-DR IgG2b de souris TU36 BD Biosciences 0,1

α-macrophages IgG1 de souris PM-2K AbD Serotec 0,5

α-CD68 IgG1 de souris KP1 DAKO 4

α-DC-SIGN IgG2b de souris 120507 R&D Systems 5

α-CD11c IgG1 de souris 3.9 BioLegend 5

α-CD169 IgG1 de souris HSn 7D2 Abcam 5

α-CD86 Ig2b de souris IT2.2 BD Biosciences 2

α-Ki-67 IgG de lapin (polyclonal) Merck Millipore Non spécifié (1/300)

Tableau 6 : Anticorps primaires utilisés pour l’immunomarquage des coupes d’iléons

Après trois lavages en PBS1X supplémenté de 0,5% Tween20, les coupes sont incubées en chambre humide et dans le noir avec les anticorps secondaires couplés à des fluorochromes ou des biotines (Tableau 7) également dilués en tampon de saturation supplémenté de 0,01% Tween20, pendant 30 minutes à température ambiante.

Anticorps Isotype reconnu

Fluorochrome Fournisseur Concentration

d’utilisation

Goat α-rabbit Ig Alexa-Fluor 546 Invitrogen 5 μg/mL

Goat α-mouse IgG1 Alexa-Fluor 488 Invitrogen 5 μg/mL

Goat α-mouse IgG1 Alexa-Fluor 546 Invitrogen 5 μg/mL

Goat α-mouse IgG2b Alexa-Fluor 488 Invitrogen 5 μg/mL

Tableau 7 : Anticorps secondaires utilisés pour l’immunomarquage des coupes d’iléons

Les coupes sont ensuite rincées par trois lavages successifs de 5 minutes en PBS1X supplémenté de 0,5% Tween20 puis à nouveau rincées en PBS1X seul. Les coupes sont finalement contre-colorées avec du 4,6-diamino-2-phénylindol (DAPI, Molecular Probes) et montées en Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates) pour observation au microscope.