L’expression des chimiokines dans les ganglions est modifiée après infection a Expression des chimiokines dans les ganglions des singes sains

Afin de déterminer l’impact de l’infection sur l’expression des chimiokines dans les ganglions, nous avons tout d’abord mesuré leur expression dans les organes des animaux sains. Comme dans l’étude n°1, douze chimiokines ont été quantifiées par RT-qPCR (Figure 25) à partir d’au moins deux morceaux de ganglions par animal sain (n=3).

Pour des raisons visuelles de représentation, l’échelle de la figure ci-dessous a été ajustée pour figurer des valeurs de 10-3

copies d’ARN cible / copie d’ARN HPRT. Ici, par souci de synthèse, je ne mentionnerai pas les chimiokines dont la quantité d’ARNm est en deçà de 10-1

copies d’ARNm (c’est à dire 10 fois moins exprimée qu’HPRT).

Dans les ganglions axillaires, la quantification de l’ARNm codant chaque chimiokine chez les animaux sains montre une expression élevée des chimiokines CXCL12 (valeur médiane 17,82 copies d’ARN/copie d’ARNm HPRT), CCL19 et CCL21 (13,36 et 45,47 copies respectivement par copie d’ARNm HPRT). Plus faiblement, les chimiokines CCL4, CCL5, CCL20 et CXCL10 semblent transcrites constitutivement dans les ganglions axillaires des singes sains. L’ARNm codant pour ces protéines est retrouvé en quantités proches du nombre de copies d’ARNm codant pour HPRT (valeurs médianes proches de 1).

Figure 25 : Expression des chimiokines dans les ganglions de macaques rhésus sains.

Quantification par RT-qPCR de 12 chimiokines chez trois macaques rhésus sains (au moins deux morceaux par singe). Chaque axe représente l’expression d’une chimiokine et la position de chaque point sur les axes représente le nombre de copies d’ARNm codant chaque chimiokine pour une copie

d’ARNm HPRT. Une couleur est associée à un morceau de ganglion.

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Dans les ganglions mésentériques des animaux sains, les chimiokines CCL19 et CCL21 sont le plus fortement exprimées (17,84 et 36,98 copies par copie d’ARNm HPRT respectivement). CXCL12 est également transcrite dans les ganglions non infectés à hauteur de la transcription du gène HPRT (valeur médiane à 4,33 copies d’ARNm/copie d’ARNm HPRT), de même que CCL4 (4,21 copies /copie d’HPRT). Les chimiokines CCL5 et CXCL10 sont transcrites constitutivement à faible niveau dans les ganglions mésentériques des singes sains.

b. Modification de l’expression des chimiokines dans les ganglions au cours de l’infection aiguë par le SIV

Pour évaluer l’impact de l’infection aiguë des ganglions sur la production de chimiokines et après avoir évalué la quantité d’ARNm codant pour chaque chimiokine à l’état basal, nous avons mesuré l’évolution de leur expression après infection des animaux par le SIV.

i) Induction de l’expression de CXCL10 et CCL5 dans les ganglions axillaires

Dans les ganglions axillaires, seules les quantités d’ARNm codant pour les chimiokines CXCL10 et CCL5 sont modifiées significativement au cours de l’infection par le SIV (Figure 26). A J10pi, l’infection des ganglions axillaires provoque une augmentation conséquente de l’expression de CXCL10 (p=0,0003) qui reste supérieure à celle des animaux sains à J14 (p=0,006). L’expression de CCL5 augmente progressivement pendant les deux premières semaines de l’infection mais n’est augmentée significativement qu’à J14pi (p=0,002).

Notons que pour toutes les autres chimiokines testées, y compris CCL19 et CCL21 dont les transcrits sont majoritaires dans le ganglion sain, les quantités d’ARNm ne diffèrent pas significativement au cours de la phase aiguë de l’infection par le SIV par rapport aux animaux contrôles non infectés (résultats non montrés).

Figure 26 : Quantification de l’ARNm codant pour CXCL10 et CCL5 dans les ganglions axillaires au cours de la phase aiguë de l’infection SIV.

Quantification par RT-qPCR de la concentration en ARNm exprimée par copie d’ARNm codant pour HPRT. Chaque couleur est attribuée à un temps post-infection et chaque symbole à un animal. La médiane est représentée par une barre horizontale noire. **p<0,01 et *** p<0,001 selon le test U de

Mann-Whitney, en comparaison avec les animaux sains.

Notons qu’à l’inverse de CCL5 dont l’expression semble augmenter graduellement au cours de l’infection aiguë, les quantités d’ARNm codant pour CXCL10 montrent une tendance à la diminution à J14pi par rapport à J10pi.

ii) Induction de l’expression de CCL5, CCL20 et CXCL10 dans les ganglions mésentériques

Dans les ganglions mésentériques comme dans les ganglions axillaires, l’expression de CXCL10 augmente significativement dès J10pi et reste supérieure à celle du groupe contrôle à J14pi (p=0,0012 et p=0,0095 respectivement). L’expression de CCL5 est augmentée au jour 14 après infection par le SIV par rapport aux singes contrôles (p=0,0095).

Alors que les transcrits codants pour CCL20 ne sont que faiblement détectables chez les animaux sains, leur quantité augmente au jour 14 après infection par le virus (p=0,03). Notons la grande variabilité de quantité d’ARNm codant CCL20 au sein d’un même singe (même symbole) et entre ces animaux à chaque temps post-infection (Figure 27).

La concentration d’ARNm codant pour toutes les autres chimiokines testées, y compris CCL19 et CCL21, reste inchangée dans les ganglions mésentériques les 14 premiers jours après infection des animaux par le SIVmac.

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Figure 27 : Quantification de l’ARNm codant CXCL10, CCL5 et CCL20

Quantification par RT-qPCR de la concentration en ARNm exprimée par copie d’ARNm codant pour HPRT. Chaque couleur est attribuée à un temps post-infection et chaque symbole à un animal. La

médiane est représentée par une barre horizontale noire. *p<0,05 et ** p<0,01 selon le test U de Mann-Whitney, en comparaison avec les animaux sains.

c. La quantité d’ARNm codant pour l’IL-7 dans les ganglions lymphatiques n’est pas modifiée pendant la phase aiguë de l’infection

D’après nos résultats de l’étude n°1, l’expression de l’IL-7 est augmentée transitoirement dans l’intestin grêle des animaux dès J3pi pour revenir à un niveau basal dès J14pi. Par ailleurs, ces modifications d’expression de l’IL-7 corrèlent avec l’expression des chimiokines CCL4, CCL5, CCL28 et CCL19.

Afin d’évaluer le caractère spécifique de ces modifications dans la muqueuse iléale, nous avons quantifié l’expression de l’IL-7 dans les ganglions lymphatiques. Dans les ganglions, la quantité d’ARNm codant pour cette cytokine reste stable au cours de l’infection aiguë par le SIV (résultats non montrés).

Chez les animaux sains, la quantité d’ARNm codant l’IL-7 est plus élevée dans les ganglions axillaires en comparaison avec la quantité d’ARNm détectée dans la muqueuse iléale (p=0,0041), Figure 28. Elle est également supérieure à celle des ganglions mésentériques drainant la muqueuse intestinale (p=0,0134). La quantité de transcrits IL-7 détectés demeure inférieure à celle des transcrits codant pour HPRT. Notons que ces résultats sont en accord avec les données de la littérature à propos de la faible expression de cette cytokine, rendant difficile sa détection par les méthodes in situ classiques, au niveau ARNm comme au niveau protéique (Mazzucchelli et al., 2009).

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Figure 28 : Quantification de l’expression de l’IL-7 dans les ganglions axillaires, mésentériques et l’iléon des animaux sains

Quantification par RT-qPCR de la concentration en ARNm exprimée par copie d’ARNm codant pour HPRT dans au moins deux morceaux d’organe par singe.

La médiane est représentée par une barre horizontale noire. Test statistique de Mann-Whitney. gg ax : ganglions axillaires, gg mes : ganglions mésentériques

Malgré une réplication virale détectable dès J10pi dans les ganglions, les quantités de transcrits codant l’IL-7 et la plupart des chimiokines testées ne sont pas modifiées au cours de l’infection aiguë par le SIV. Ces résultats suggèrent que (i) les modifications d’expression de l’IL-7 induite par le virus sont spécifiques à la muqueuse intestinale et que (ii) l’augmentation de la transcription des chimiokines CXCL10, CCL5 dans les ganglions axillaires et de ces mêmes protéines additionnées de CCL20 dans les ganglions mésentériques ne sont pas induites par des modifications d’expression de l’IL-7 dans ces organes.

L’expression de nombreuses chimiokines est également augmentée spécifiquement et transitoirement dans la muqueuse iléale comparée au colon (étude n°1 et résultats non montrés). Ces résultats indiquent que l’infection des PNH par le SIVmac induit des modifications importantes du profil d’expression de l’IL-7 et des chimiokines spécifiquement dans l’intestin grêle des animaux, plus large segment du tractus intestinal et cible privilégiée de la réplication virale les premiers jours après infection.

Les modifications profondes de l’expression des chimiokines par la muqueuse iléale sont concomitantes aux fluctuations du nombre de lymphocytes T observées dans le sang. Ainsi, l’augmentation de la production de chimiokines jusqu’au jour 10pi est probablement à la base d’un recrutement massif de lymphocytes T périphériques, naïfs et mémoires, quittant la circulation sanguine pour rejoindre le tissu infecté.

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De façon intrigante, au jour 14pi, alors que les chimiokines voient leur expression diminuée dans la muqueuse iléale, le nombre des lymphocytes T des compartiments CD4 et CD8 naïfs atteint à nouveau son niveau de base. Afin de mieux comprendre ce rebond des cellules naïves en périphérie, j’ai participé à explorer l’impact de l’infection SIV sur la fonction thymique des macaques rhésus au cours de l’infection aiguë par le SIV (publication n°2).

III. Etude n°2.