Hormones et infections

En régulant la réponse immunitaire, les hormones peuvent favoriser le développement et/ou la sévérité d’infections microbiennes. Les femmes ont une réponse immunitaire cellulaire et humorale plus robuste que les hommes après challenge par un antigène. Cependant, cette règle générale doit être nuancée par le statut hormonal féminin qui varie en fonction du cycle menstruel, des méthodes de contraception et de la grossesse (231). Au cours de la grossesse, les taux d’hormones stéroïdiennes sont très élevés et favorisent une réponse Th2 au détriment de la réponse Th1, entrainant une plus grande susceptibilité à certains types d’infections. La prévalence de la listériose et du paludisme, et la sévérité de la grippe et de la fièvre typhoïde sont plus élevées chez les femmes enceintes (232).

Concernant Salmonella, Karapetrovic et coll. ont montré que des souris gravides infectées par Salmonella Typhimurium avaient un taux de mortalité supérieur, un nombre de bactéries dans la rate multiplié par 1000 et un nombre de cellules phagocytaires diminué en comparaison à des souris non gravides (233). Le rôle des hormones, à des concentrations équivalentes à celles retrouvées en fin de grossesse, a été démontré par des expériences où des souris infectées et préalablement traitées par de l’œstradiol développaient une infection plus sévère que les souris contrôles, et que les souris traitées par de la progestérone résistaient plus à l’infection (234).

D’autres études se sont intéressées aux effets des œstrogènes sur l’infection à L.

monocytogenes et ont montré que l’estradiol ou le diéthylstilbestrol (un estrogène

synthétique) favorisent l’infection à L. monocytogenes après infection par voie intraveineuse ou intra péritonéale (235–237). Aux concentrations utilisées (1,5 mg/kg/jour pendant 7 jours) l’œstradiol inhibait la réponse immunitaire anti-infectieuse et les macrophages isolés de souris traitées avaient une capacité de phagocytose plus importante que les cellules contrôles mais une activité bactéricide moindre (237).

Une étude a montré que l’œstradiol pouvait modifier les propriétés des cellules épithéliales vaginales et promouvoir ainsi la colonisation de SGB. En effet, des souris ayant

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reçu de l’œstradiol sont maintenues de manière artificielle en phase « œstrus » et leurs cellules épithéliales vaginales se kératinisent ce qui favorise la colonisation vaginale à SGB à long terme (238).

Enfin, une seule étude s’est intéressée à l’effet de l’œstradiol et de la progestérone sur l’infection à SGB, et plus particulièrement sur la réponse cytokinique de cellules immunitaires de NN en réponse à SGB. Giannoni et ses collaborateurs ont montré qu’en présence de SGB, les monocytes isolés de sang de cordon sécrétaient des cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα (500 pg/mL) et de l’IL-6 (100 pg/mL) et que l’incubation préalable de ces monocytes pendant 16 heures avec de l’œstradiol ou de la progestérone inhibait la production de ces cytokines pour des concentrations supérieures à 10 nM d’œstradiol et 0,1 µM de progestérone, soit des concentrations équivalentes à celles retrouvées en fin de grossesse pour l’œstradiol ou à une semaine de vie pour la progestérone (239).

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Contexte et objectifs des travaux

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Contexte et objectif des travaux

La thématique principale du laboratoire est l’étude des interactions hôte(s)- pathogène(s) et en particulier les mécanismes physiopathologiques et moléculaires mis en jeu lors du franchissement des barrières de l’hôte par les bactéries. Le travail réalisé dans le laboratoire depuis plus de 10 ans a permis de caractériser des protéines spécifiques du clone hypervirulent CC-17, à savoir HvgA et Srr2, dans des modèles d’études in vitro d’interactions avec des cellules épithéliales et endothéliales en lien avec la physiopathologie des infections à SGB, ainsi que dans des modèles plus complexes in vivo d’infections dans des modèles murins. Cependant, les différents déterminants bactériens identifiés et caractérisés contribuant à la virulence de SGB ne peuvent à eux seuls expliquer le déterminisme unique des souches de SGB CC-17 vis à vis des nouveau-nés.

Des facteurs d’hôte pourraient favoriser les infections à SGB et notamment aux souches hypervirulentes CC-17. La susceptibilité particulière des nouveau-nés aux infections est attribuée principalement à un défaut de réponse immunitaire innée (176). Les hormones stéroïdiennes comme l’œstradiol et la progestérone régulent de manière concentration dépendante la réponse immunitaire, la perméabilité des barrières cellulaires, et l’expression de molécules d’adhésion (210, 212, 225). En outre, les taux d’hormones sont très importants à la naissance, puis chutent drastiquement dans les trois premiers jours de vie et se stabilisent pour quelques mois à des taux 5 à 50 fois plus élevés que chez l’adulte.

L’objectif principal du travail mené au cours de ma thèse a été de déterminer l’impact de l’imprégnation hormonale en œstradiol et en progestérone à des concentrations équivalentes à celles retrouvées à la naissance et au-delà de 7 jours de vie sur la virulence de SGB et du clone CC-17 chez les nouveau-nés. Pour ce faire, nous avons combiné des approches utilisant des modèles cellulaires et murins d’infection reproduisant de façon pertinente la physiopathologie des infections néonatales à SGB. Deux souches représentatives de SGB, largement utilisés comme modèle dans de nombreux laboratoires, de sérotype capsulaire III, BM110 (CC-17) et NEM316 (CC-23) et dont le génome a été entièrement séquencé (99, 118). L’objectif secondaire de ce travail était de mettre à profit les éventuels effets des hormones stéroïdiennes sur l’expression de récepteurs cellulaires pour mieux caractériser les

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mécanismes moléculaires de franchissement des barrières par le SGB et identifier à plus long terme les cibles cellulaires de SGB CC17 en particulier.

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Résultats expérimentaux

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Résumé des principaux résultats

Les concentrations hormonales périnatales favorisent la translocation

intestinale via les cellules M du streptocoque du groupe B hypervirulent CC-17

Article en préparation

Le SGB est un pathogène néonatal dont la majorité des souches responsables d’infections tardives appartiennent au CC-17. Ce clone possède des facteurs de virulence spécifiques pouvant favoriser le franchissement des barrières cellulaires, notamment intestinale (29, 60). Cependant, ces facteurs ne peuvent expliquer à eux seuls l’étroite association qu’il existe entre les souches de ce CC d’une part, et les NN d’autre part. Nous avons déterminé l’impact de l’imprégnation hormonale en œstradiol (E2) et en progestérone (P4) à des concentrations équivalentes à celles retrouvées à la naissance (E2-P4 D0) et au-delà de 7 jours de vie (E2-P4 D7) sur la virulence de SGB et du clone CC-17 (191, 195, 240). Pour cela, nous avons mis au point des modèles cellulaires et murins d’imprégnation hormonale et d’infection utilisant deux souches représentatives de SGB toutes deux de sérotype capsulaire III, à la fois le clone hypervirulent CC-17 (BM110) et un SGB non CC-17 (NEM316, CC-23).

1. Les taux circulants d’E2-P4 modulent spécifiquement la virulence de SGB CC-17 dans un modèle murin de méningite après infection par voie orale.

Nous avons démontré dans un modèle murin de méningite après infection par voie orale mis au point au laboratoire (29) que les hormones E2-P4 D7 favorisaient spécifiquement la sévérité de la méningite à SGB CC-17 (Fig. 32). Après gavage par SGB CC-17, les souris E2-P4 D7 avaient significativement plus de bactéries dans le cerveau 2h et 24h après l’infection. L’expérience menée avec une souche SGB CC-23 ne montrait pas d’effet hormone-dépendant dans la sévérité de la méningite aux concentrations utilisées, démontrant que la concentration hormonale E2-P4 D7 en comparaison de la condition E2-P4 D0 favorisait la survenue de méningite uniquement pour les souches CC-17.

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Fig. 32. Les hormones E2-P4 D7 modulent la sévérité de la méningite.

Les souris BALB/c âgées de 3 semaines ont reçu par injection sous-cutanée des concentrations d’E2 et de P4 conduisant à des concentrations circulantes équivalentes à celles retrouvées à la naissance (E2-P4 D0) et à 7 jours de vie (E2-P4 D7). La figure montre le nombre de bactéries (unité formant colonies, UFC) totales dans le cerveau 2 heures et 24 heures après infection par voie orale avec 2.1010 _{UFC de SGB. * p<0.05 ; ** p<0.01 ; ns : non significatif (2-way ANOVA).}

2. Les concentrations hormonales E2-P4 D7 favorisent le franchissement de la barrière intestinale au niveau des plaques de Peyer ainsi que la dissémination de SGB CC-17

Afin d’étudier le rôle des hormones dans le franchissement de la barrière intestinale, nous avons quantifié les bactéries dans les ganglions mésentériques lymphatiques (MLN), le sang et la rate après infection par voie orale par SGB CC-17 (Fig. 33). Deux heures après l’infection, le nombre de bactéries était environ dix fois supérieur dans les différents organes périphériques chez les souris E2-P4 D7 par rapport aux souris E2-P4 D0, démontrant que la concentration hormonale E2-P4 D7 favorisait le franchissement de la barrière intestinale de SGB CC-17.

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Fig. 33. Les hormones E2-P4 D7 favorisent le franchissement de la barrière intestinale et la dissémination de SGB CC-17 après infection par voie orale.

Les souris BALB/c âgées de 3 semaines ont reçu par injection sous-cutanée des concentrations d’E2 et de P4 conduisant à des concentrations circulantes équivalentes à celles retrouvées à la naissance (E2-P4 D0) et à 7 jours de vie (E2-P4 D7). La figure montre le nombre de bactéries totales (UFC) dans les MLN et la rate, et le nombre de bactéries par mL de sang 2 heures après infection par voie orale avec 2.1010 _{UFC de SGB CC-17. * p<0.05 ; ** p<0.01 (t-test).}

Les plaques de Peyer (PP) constituant une porte d’entrée pour de nombreux pathogènes (135, 148), nous avons comparé l’association et l’invasion de SGB CC-17 avec les PP d’une part et le reste de l’intestin d’autre part, par dénombrement des bactéries après infection par voie orale (Fig. 34). Après infection orale et alors que l’association aux différents tissus était équivalente quelles que soient les conditions, le taux d’invasion de SGB CC-17 dans les PP était 20 fois supérieur au reste de l’intestin, avec un taux d’invasion dans les PP supérieur en E2-P4 D7 par rapport à D0. Ces résultats indiquent que les PP constituent une porte d’entrée intestinale privilégiée pour SGB CC-17.

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Fig. 34. Le SGB CC-17 traverse la barrière intestinale via les plaques de Peyer, processus favorisé par les conditions hormonales E2-P4 D7.

Les souris BALB/c âgées de 3 semaines ont reçu par injection sous-cutanée des concentrations d’E2 et de P4 conduisant à des concentrations circulantes équivalentes à celles retrouvées à la naissance (E2-P4 D0) et à 7 jours de vie (E2-P4 D7). Deux heures après infection par voie orale par 2.1010 _{SGB CC-17, les intestins grêles ont été prélevés et les plaques de Peyer} individualisées du reste du tissu. La figure représente le nombre de bactéries par gramme de tissu associées aux plaques de Peyer ou au reste de l’intestin (A) et le nombre de bactéries intra-tissulaires quantifiées après traitement des tissus par gentamicine (200 µg/mL) pour éliminer les bactéries extra-tissulaires (B). * p<0.05 ; ** p<0.01 (2-way ANOVA).

L’épithélium associé aux PP est caractérisé par la présence de cellules M dont le rôle est d’assurer la transcytose d’antigènes et de bactéries présents dans la lumière intestinale et leur adressage aux cellules immunitaires présentes dans la lamina propria telles que les cellules dendritiques (DC) et les macrophages. L’analyse par microscopie confocale d’anses intestinales ligaturées et infectées par SGB CC-17, a montré la présence de SGB CC-17 à l’intérieur de cellules M (Fig. 35 A) ainsi que des SGB CC-17 associés à des DC ou macrophages exprimant le récepteur CD11c (Fig. 35 B).

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Fig. 35. Localisation cellulaire de SGB CC-17 après infection d’anses intestinales ligaturées.

Anses intestinales ligaturée et infectées 1h avec 2.1010 _{SGB CC-17 au niveau de l’intestin grêle} de souris BALB/c de 3 semaines dans la condition E2-P4 D7. Images acquises avec un microscope confocal. (A) Visualisation de SGB CC-17 associé à une cellule M (B) ainsi que des SGB CC-17 en contact avec des DC/macrophages.

3. Les concentrations hormonales E2-P4 D7 favorisent spécifiquement la phagocytose de SGB CC-17 par la protéine de surface HvgA

Le SGB CC-17 pouvant être associé aux DC/macrophages intestinaux dans la lamina

propria, nous avons étudié l’impact des hormones sur la capacité de macrophages à assurer

la phagocytose et la clairance des bactéries. Pour cela, nous avons utilisé des monocytes humains que nous avons différenciés en macrophages en présence des hormones E2-P4 D0 et E2-P4 D7. De manière intéressante, la phagocytose de SGB CC-17 était doublée en condition E2-P4 D7 alors que celle de SGB CC-23 restait inchangée (Fig. 36 A). Comme la survie bactérienne demeurait inchangée par les hormones (cf. article en préparation), l'infection des macrophages par SGB CC-17 en condition E2-P4 D7 était corrélée à un taux de bactéries intracellulaires deux fois plus élevé que dans la condition E2-P4 D0, 8 heures après l’infection (Fig. 36 B).

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Fig. 36. La condition hormonale E2-P4 D7 favorise spécifiquement la phagocytose de SGB CC-17.

Les monocytes humains THP-1 ont été différenciés en macrophages et cultivés pendant 7 jours en présence de E2-P4 D0 ou E2-P4 D7. Après infection avec un rapport une bactérie pour une cellule pendant 45 minutes, le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant de la gentamicine pendant 1h afin d’éliminer les bactéries extracellulaires. Les lysats cellulaires ont été récupérés après 1h de traitement par gentamicine pour évaluer la phagocytose (A) ou après 7 heures pour évaluer la survie (B). *** p<0.001 ; ns : non significatif (2-way ANOVA).

L'hyper-phagocytose spécifique de SGB CC-17 observée en E2-P4 D7 suggérait l'implication d'une protéine spécifique de ce CC. L’analyse de la phagocytose de souches CC-17 inactivées pour les protéines de surface spécifiques Srr2 et HvgA précédemment caractérisées par le laboratoire (29, 60) montrait que ces deux protéines étaient impliquées dans la phagocytose (cf. article en préparation), mais seul le mutant ∆hvgA ne présentait pas l’hyper-phagocytose en condition E2-P4 D7 (cf. article en préparation). De plus, l'expression hétérologue de HvgA dans Lactococcus lactis, bactérie non pathogène et membre des Streptococcaceae, était suffisante pour promouvoir sa phagocytose en condition E2-P4 D0 et la favoriser en condition E2-P4 D7 (Fig. 37), désignant HvgA comme un intervenant majeur dans l’hyperphagocytose de SGB CC-17.

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Fig. 37. La protéine de surface HvgA spécifique de SGB CC-17 promeut la phagocytose en condition hormonale E2-P4 D7.

Les monocytes humains THP-1 ont été différenciés en macrophages et cultivés pendant 7 jours en présence de E2-P4 D0 ou E2-P4 D7. Après infection avec un rapport une bactérie pour une cellule pendant 45 minutes, le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant de la gentamicine pendant 1h afin d’éliminer les bactéries extracellulaires. Les lysats cellulaires ont été récupérés après 1h de traitement par gentamicine pour évaluer la phagocytose. ** p<0.01 *** p<0.001 (2-way ANOVA).

4. Les concentrations hormonales E2-P4 D7 augmentent la transcytose de SGB CC-17 par les cellules M par un mécanisme dépendant de la protéine Srr2

Pour explorer le rôle spécifique des hormones dans le franchissement de la barrière intestinale par les cellules M, nous avons étudié le franchissement de SGB à travers une monocouche composée d’entérocytes et de cellules M, obtenue après co-culture de Caco-2 avec des lymphocytes B Raji (241). Alors que les hormones ne modifiaient pas la proportion de cellules M obtenue dans ce modèle (données non montrées), les hormones à la concentration E2-P4 D7 favorisaient la transcytose de SGB CC-17 à travers la monocouche entérocytes/cellules M (Fig. 38 A et D), sans modification de la cytotoxicité ni altération des jonctions intercellulaires (données non montrées). Pour confirmer le rôle des cellules M dans la transcytose de SGB, nous avons analysé par immunofluorescence et quantifié l’interaction entre SGB et les différentes cellules épithéliales, à savoir les entérocytes d’une part et les cellules M d’autre part. Au total, 50% des SGB CC-17 étaient associés aux cellules M pour seulement 10% des SGB CC-23 (Fig. 38 B). De plus, la proportion des SGB CC-17 associés aux cellules M était plus importante en condition hormonale D7 pour un même nombre de cellules M (Fig. 38 C).

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Fig. 38. La protéine de surface Srr2 spécifique de SGB CC-17 promeut l’association aux cellules M en condition hormonale E2-P4 D7.

Les entérocytes Caco-2 ont été cultivés sur filtres pendant 14-21 jours, puis les lymphocytes B Raji ont été ajoutés dans le compartiment basal pour 6-7 jours supplémentaires, en présence d’hormone E2-P4 D0 ou E2-P4 D7. Les lymphocytes ont été retirés et les cellules épithéliales infectées par SGB par leur pôle apical, dans un rapport de 100 bactéries pour une cellule, pendant 2 heures. La transcytose (A) et (F) correspond au pourcentage de bactéries dans le milieu basal 2 heures après infection rapporté à l’inoculum. (D) Image représentative et acquise par microscopie confocale, montrant la présence de SGB CC-17 à l’intérieur d’une cellule M. (B-C-E) Analyses quantitatives d’images représentant le niveau d’association des bactéries aux cellules M. * p<0.05 ; ** p<0.01 ; *** p<0.001 (A, B, C : t-test ; E : 1-way ANOVA ; F : 2-way ANOVA).

La forte association retrouvée entre les cellules M et les souches CC-17 nous a incité à déterminer l’implication potentielle des protéines de surfaces spécifiques HvgA et Srr2 dans ce phénotype. Pour ce faire nous avons utilisé les mutants inactivés par délétion des gènes codant pour ces deux adhésines, ∆hvgA et ∆srr2, précédemment caractérisés (29, 60). Les résultats de l’analyse quantitative par imagerie de l’association entre SGB et cellules épithéliales montrent que les protéines HvgA et Srr2 sont toutes les deux impliquées dans l’adhésion à la monocouche cellulaire (cf article), mais que seule la protéine Srr2 semble impliquée dans l’association de SGB CC-17 aux cellules M, avec une réduction de 50% de l’association du mutant ∆srr2 avec les cellules M par rapport à la souche sauvage (Fig. 38 E).

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La contribution de Srr2 dans la translocation à travers les cellules M a été confirmée par la diminution de la transcytose du mutant ∆srr2 et par la perte du phénotype d’hyper- transcytose en condition hormonale E2-P4 D7 (Fig. 38 F).

5. La protéine de surface Srr2 contribue à l’invasion des plaques de Peyer et à la sévérité de la méningite en condition hormonale D7

Ces observations in vitro révèlent l’importance de la protéine Srr2 dans le franchissement de la barrière intestinale des souches SGB CC-17, en particulier dans les conditions hormonales dans lesquelles sont les nouveau-nés à 7 jours de vie. Nous avons confirmé cette hypothèse in vivo, en utilisant le modèle murin de méningite précédemment utilisé. Les résultats (Fig. 39) montrent que la protéine Srr2 est impliquée dans l’association et dans l’invasion des PP, dans la dissémination via les MLN, et dans l’invasion du système nerveux central. De plus, les hormones E2-P4 D0 et E2-P4 D7 ne modulent pas l’infection par ∆srr2, démontrant que Srr2 participe à l’augmentation de la virulence observée en condition hormonale E2P4 D7.

Fig. 39. La protéine de surface Srr2 spécifique du clone hypervirulent CC-17 promeut la translocation intestinale de SGB.

Les souris BALB/c âgées de 3 semaines ont reçu par injection sous-cutanée des concentrations d’E2 et de P4 conduisant à des concentrations circulantes équivalentes à celles retrouvées à la naissance (E2-P4 D0) et à 7 jours de vie (E2-P4 D7) puis infectées par voie orale 2.1010 _UFC de SGB CC-17 ou du mutant ∆srr2. (A) Nombre de SGB associés (adhérent et intra-tissulaire) aux PP ou au reste de l’intestin. (B) Nombre de SGB intra-tissulaires quantifiés après traitement par gentamicine (200 µg/mL) dans les PP ou dans le reste de l’intestin. Nombre total de bactéries dans les MLN (C) et dans le cerveau (D).

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Article

Perinatal hormonal concentrations favor CC17 group B Streptococcus

hypervirulence and intestinal translocation through M cells

Constantin Hays1,2,3_{, Gérald Touak}1_{, Abdelouhab Bouaboud}1,3_{, Julie Guignot}1,3_{, Agnès Fouet}1,3_, Claire Poyart1,2,3 _{and Asmaa Tazi}1,2,3*

1_{Team Barriers and Pathogens, Cochin Institute, INSERM U1016 - UMR CNRS 8104, 75014 Paris} 2_{Department of Bacteriology, University Hospitals Paris Centre-Cochin, AP-HP}

3_{Paris Descartes University, Paris}

*_{Corresponding author and Lead Contact} Asmaa Tazi, asmaa.tazi@aphp.fr

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Summary

Group B Streptococcus (GBS) is the leading cause of invasive bacterial neonatal infections. Half of the cases are late-onset diseases (LOD) largely due to a particular GBS clone designated CC17. However, CC17 invasion route and host factors involved in its association with LOD remain elusive. We studied the impact of estradiol (E2) and progesterone (P4) to which the fetus is exposed during pregnancy on the pathophysiology of GBS infections. In cellular and mouse models of hormonal concentrations found at birth (E2-P4 D0) and over 7 days (E2-P4 D7), E2-P4 D7 concentrations specifically favor the severity of CC17 GBS meningitis following mice oral infection. CC17 GBS crosses the intestinal barrier through M cells found in Peyer’s patches in a process enhanced by E2-P4 D7 concentrations and dependent on the CC17 surface protein Srr2, demonstrating the cellular pathway for CC17 intestinal translocation and providing an explanation for neonates’ susceptibility to CC17 LOD.

Keywords

Streptococcus agalactiae, Group B Streptococcus, CC17 clone, neonatal infection, estradiol,

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Introduction

Group B Streptococcus (Streptococcus agalactiae, GBS) is a natural inhabitant of the gastrointestinal and vaginal flora of 10 to 30% healthy individuals. This Gram positive encapsulated bacterium can also turn into a deadly pathogen especially in neonates and is recognized as a leading cause of neonatal invasive infections (bacteremia, meningitis) (Edwards MS, Nizet V, Baker CJ., 2011). Despite appropriate neonatal care and antibiotic therapy, the global burden of GBS neonatal infections remains substantial, with up to 10% mortality and 30% neurologic sequelae in surviving infants. Two GBS-associated syndromes are distinguished in neonates, the early-onset disease (EOD) which occurs within 48 hours after birth in 90% of the cases, and the late-onset disease (LOD) between 7 and 89 days of life (Edwards MS, Nizet V, Baker CJ., 2011). EOD primarily manifests as pneumonia and bacteremia subsequent to the inhalation by the neonate of GBS contaminated amniotic fluid or vaginal