5.3.1. Desenho experimental – DOE
De forma a otimizar o processo extrativo e aumentar o rendimento de extração, recorreu-se ao desenho experimental ou Design of Experiments (DOE). O DOE é uma ferramenta estatística que permite o planeamento de todo o processo, avaliando de forma multivariada os diversos fatores intervenientes, minimizando os efeitos dos fatores não controlados e o número de experiências. Assim, conseguem-se melhores resultados e um uso racional dos recursos. O tratamento de resultados foi efetuado no programa estatístico MINITAB, versão 16.
Os fatores analisados durante este estudo foram o número de aspirações, o volume de ácido acético e de metanol (soluções de lavagem) e a volume de hidróxido de amónio utilizada (solução de eluição). Para a avaliação das interações entre estes fatores foi feito um planeamento fatorial completo com 2 níveis (24) e controlo por ponto intermédio (em triplicado).
O procedimento extrativo a utilizar foi o anteriormente descrito. As amostras de plasma a um volume de 200 µL sofreram uma diluição 1:10. Os compostos foram analisados a três diferentes concentrações: 250, 500 e 750 ng/mL. Apresenta-se de seguida a matriz experimental (Tabela 6) utilizada neste estudo bem como a resposta obtida para cada composto.
A resposta foi obtida como razão entre a área do ião quantificador de cada composto e a área do ião quantificador do padrão interno (n=1) correspondente que foi adicionado no
fim da extração. Apresentam-se em seguida os diagramas de Pareto obtidos por análise dos resultados do DOE.
Tabela 6 – Matriz experimental e resultados das extrações.
Ordem Aspirações CHVolume 3COOH
1% Volume MeOH 10% Volume NH4OH 5% Resposta Ketamina mCPP TFMPP MeOPP 7 4 500 200 50 0,01 0,16 0,21 0,08 2 16 250 100 200 0,02 0,18 0,23 0,13 4 16 500 100 50 0,02 0,17 0,26 0,11 8 16 500 200 200 0,02 0,16 0,26 0,12 6 16 250 200 50 0,02 0,15 0,25 0,16 10 10 375 150 125 0,02 0,16 0,22 0,27 5 4 250 200 200 0,02 0,18 0,23 0,12 9 10 375 150 125 0,02 0,21 0,30 0,22 1 4 250 100 50 0,01 0,17 0,20 0,15 11 10 375 150 125 0,02 0,23 0,28 0,21 3 4 500 100 200 0,02 0,17 0,23 0,17
Através do gráfico da Figura 19, pode-se afirmar que para todos os compostos e todos os fatores obtém-se um melhor rendimento da extração no ponto intermédio.
Figura 19 - Gráfico dos efeitos principais dos fatores suscetíveis de influenciar o processo de extração para cada composto.
Na Figura 20, apresentam-se os gráficos de interações entre os vários fatores para cada um dos compostos estudados.
Figura 20- Gráficos representativos das interações entre os vários parâmetros para cada composto. Os parâmetros que influenciam o processo de extracção encontram-se assinalados.
Analisando esta figura, podemos observar que para a mCPP e a MeOPP entre o número de aspirações e o volume de ácido acético 1% e volume de metanol 10% existe uma interação, isto é, a resposta relativamente a um fator depende do nível de outro fator (vermelho). Para a MeOPP existe ainda a interação entre o número de aspirações e o volume de hidróxido de amónio 5% (laranja).
Existe ainda uma interação entre o volume de ácido acético 1% com o volume metanol 10% para a K, TFMPP e MeOPP (verde) e com o volume de hidróxido de amónio 5% para a K, mCPP e MeOPP (azul).
Por último, verifica-se uma interação entre o volume de metanol 10 % e o volume de hidróxido de amónio 5% para a K (amarelo).
Os diagramas de Pareto da Figura 21 representam os efeitos para cada analito de cada um dos fatores individualmente e combinados por ordem decrescente de magnitude, representados por barras horizontais. Verifica-se que o único fator estatisticamente significativo na resposta do método de extração é a combinação dos quatro fatores na MeOPP.
Figura 21 - Diagramas de Pareto que representam os fatores que influenciam o processo de extração para cada composto individualmente.
Após a análise detalhada dos resultados, foram definidos os seguintes parâmetros no procedimento de extracção final: 10 aspirações, lavagem com 250 μL de ácido acético 1% (1 vez) e com 150 μL da solução de metanol a 10% (1 vez) e eluição com 50 μL de hidróxido de amónio a 5% (1 vez).
6. Validação
Com a finalidade de demonstrar que os processos analíticos se adequam ao fim a que se destinam, é necessário efetuar a validação do método. Deste modo, a metodologia otimizada foi validada através de um protocolo de validação de 5 dias, seguindo as normas aceites internacionalmente para a validação de métodos bioanalíticos, concretamente da
Food and Drug Administration (FDA) e da International Conference on Harmonization (ICH)
[56,57].
Os parâmetros estudados foram a seletividade, linearidade e modelo de calibração, precisão e exatidão, limites de deteção e quantificação, recuperação e estabilidade.
6.1. Seletividade
A seletividade é definida como a capacidade um método analítico para diferenciar e quantificar o analito na presença de outros componentes na amostra [56].
A identificação inequívoca do composto na amostra, por GC-MS/MS em modo MRM, pressupõe o reconhecimento de dois iões diagnóstico no fragmentograma. É importante monitorizar as suas intensidades relativas e por isso há necessidade de estabelecer quais os critérios de aceitação admitidos para as abundâncias relativas dos sinais iónicos. A abundância relativa de um ião diagnóstico, expressa como percentagem da intensidade do ião mais intenso (pico base) é determinada por integração da área do pico cromatográfico selecionado normalizada ao pico base (que corresponde a 100%). Na Tabela 7 encontram-se descritos os intervalos de aceitação permitidos para as abundâncias relativas utilizados na identificação dos compostos em estudo [58].
Tabela 7 - Intervalos máximos de tolerância permitidos para as abundâncias relativas dos iões, monitorizados em modo MRM e expressos em percentagem (%) [58].
Abundância relativa
(% do pico base) Janela máxima de tolerância permitida (EI-GC/MS) > 50% ±10% (intervalo absoluto)
25% a 50% ±20% (intervalo relativo) 5% a <25% ±5% (intervalo absoluto) <5% ±50% (intervalo relativo)
Além das abundâncias relativas, os critérios de confirmação qualitativa incluem ainda o tempo de retenção relativo do composto (trR), expresso pela razão entre o tr do composto e o tr do padrão interno (deverá ser inferior ou igual a 1% quando comparado ao trR do mesmo composto numa amostra controlo analisada contemporaneamente). A razão entre o
sinal do ião diagnóstico menos intenso e o sinal correspondente ao ruído da linha de base (razão sinal/ruído) deve ser superior a 3:1 [56,58].
Por forma a avaliar a seletividade do método proposto, foram processadas pools de amostras em branco (n=6) procedentes do staff do laboratório e de diferentes origens, de forma a verificar a existência de alguma interferência, quer devido a componentes endógenos ou outros produtos exógenos contidos na matriz. Além destas amostras branco, amostras de plasma (n=6) foram fortificadas com várias substâncias como anfetaminas, analgésicos, antipsicóticos, THC e cocaína à concentração de 100 ng/mL. As Figuras 22a, 22b e 23 representam os cromatogramas do branco e da amostra fortificada com outros compostos e com os analitos de estudo respectivamente.
Figura 22a – Cromatograma de uma amostra branca.
K mCPP TFMPP MeOPP K-D4 oCPP MeOPP mCPP TFMPP K
Figura 22b – Cromatograma de uma amostra de plasma fortificada com anfetaminas, cocaína, antipsicóticos, THC e analgésicos (100 ng/mL).
Figura 23 - Cromatograma de uma amostra de plasma fortificada com os analitos de estudo a 100 ng/mL e padrões internos a 250 ng/mL. K mCPP TFMPP MeOPP oCPP K-D4 MeOPP mCPP TFMPP K mCPP mCPP K oCPP K TFMPP TFMPP K-D4 MeOPP MeOPP
Pela análise das amostras, de acordo com os critérios acima descritos, podemos afirmar que o método é seletivo, já que em nenhuma das situações (Figura 22a e 22b) foi observado qualquer tipo de interferente, nos tempos de retenção e iões escolhidos dos analitos em estudo, ketamina e piperazinas (TFMPP, MeOPP e mCPP).