Gestion du milieu fluidique des pi`eges

3.2.1 Le principe des chambres de mesure . . . 62 3.2.2 Renouvellement du milieu des chambres de mesure . . . 63 3.2.3 Estimation du temps de renouvellement . . . 64

3.1. Un dispositif pour pi´eger des cellules 57

3.1 Un dispositif pour pi´eger des cellules

Consid´erons dans un premier temps le positionnement de cellules dans un dispositif

micro-fluidique. Cette ´etape est la premi`ere d’une longue s´erie d’exp´eriences menant in fine `a des

mesures sur cellules. Elle se doit donc d’ˆetre simple et efficace, afin d’´eviter de rendre l’ensemble

de l’exp´erimentation irr´ealisable.

3.1.1 Pi´egeage de cellules

De nombreuses techniques ont ´et´e d´evelopp´ees pour positionner des cellules dans un

mi-crosyst`eme. Nous pouvons en distinguer deux grandes cat´egories, le positionnement actif et le

positionnement passif.

Dans le cas du positionnement actif, les objets sont suivis par microscopie. L’utilisateur

immobilise sa cible au moment et `a l’emplacement voulus par le biais de divers actionneurs

di´electrophor´etiques [97], fluidiques [98, 99, 100], optiques [84, 101] ou ´electromagn´etiques [102,

79, 103] parmi d’autres. Dans certains cas, les pi`eges peuvent ˆetre eux-mˆemes contrˆol´es, d´eplac´es,

comme lors de l’utilisation de pinces optiques [84], et de nombreuses op´erations peuvent avoir

lieu, comme pour la _«chirurgies `a l’´echelle nanom´etrique<sub>»</sub> [104]. Ces syst`emes polyvalents

permettent une manipulation extrˆemement pr´ecise et adaptable `a chaque exp´erimentation. Ils

s’accompagnent invariablement d’une observation et d’un contrˆole constants de l’utilisateur.

Ces syst`emes sont d´edi´es soit `a une s´election sp´ecifique des objets o`u la suite des mesures est

routini`ere et automatis´ee, mais dont le montage est peu flexible, soit `a des probl´ematiques

n´ecessitant une gestion des op´erations au cas par cas. Ces syst`emes sont peu adapt´es aux

ques-tions n´ecessitant une r´eponse statistique puisque leur mise en œuvre ne peut ˆetre automatis´ee.

Dans le cas contraire, pour le positionnement passif, l’intervention de l’utilisateur est

mini-male et l’immobilisation des cellules est automatique, syst´ematique et donc parall´elisable. Les

pi`eges en eux-mˆemes peuvent ˆetre de plusieurs natures : chimique [40, 105, 106],

´electromagn´e-tique [107, 108], acous´electromagn´e-tique [109] ou encore d´ependante de la structure du dispositif. La derni`ere

cat´egorie de pi`eges nous int´eresse plus particuli`erement puisque c’est elle qui procure la plus

grande facilit´e de fabrication et d’utilisation, une fois la phase de d´eveloppement pass´ee. Les

premiers exemples de positionnement cellulaire dans les puces microfluidiques sont bas´es sur la

s´edimentation des cellules au-dessus de structures impl´ement´ees au fond du canal pour former

un r´eseau de puits. Le surplus de cellules est ensuite chass´e par le flux qui ne perturbe pas le

mi-lieu fluidique des puits. Ce type de dispositif a ´et´e particuli`erement utilis´e pour les dispositifs de

criblage par fluorim´etrie [110, 111]. Enfin, le dernier grand type de pi`eges est bas´e sur le principe

de barrage ou de filtre. Ces dispositifs contiennent des structures plac´ees en travers du flux de

cellules, bloquant dans ces pi`eges ainsi form´es un nombre de cellules d´etermin´e [112, 113, 114].

La classification des dispositifs de positionnement cellulaire ´evoqu´ee dans ce paragraphe est

loin d’ˆetre exhaustive. Chacun de ces dispositifs a ´et´e d´evelopp´e pour une application particuli`ere,

dans un environnement de laboratoire particulier. La flexibilit´e dans la conception des dispositifs

microfluidiques permet de tirer parti au maximum du potentiel `a notre disposition, que ce soit en

logistique ou en expertise. Pour cela, une imagination au-del`a des rep`eres est souvent n´ecessaire.

3.1.2 Pi`eges pour cellules dans un dispositif destin´e `a des mesures ´

electro-chimiques

Dans le cas d’un dispositif de positionnement cellulaire destin´e `a ˆetre int´egr´e dans un

dis-positif final de mesures ´electrochimiques sur cellules, l’environnement fluidique des chambres de

mesure doit ˆetre particuli`erement stable. En effet, aucun flux r´esiduel ne doit perturber ni la

mesure ni l’objet de mesure. D’une part, les signaux mesur´es ´etant particuli`erement faibles, la

stabilit´e de l’environnement de mesure assurera le minimum de perte des signaux. D’autre part,

les cellules ´etant elles-mˆemes des objets fragiles et sensibles `a leur environnement, la moindre

instabilit´e pourrait constituer un stress suppl´ementaire.

Configuration en cul-de-sac

Pour assurer une telle stabilit´e de milieu dans les pi`eges, nous avons envisag´e une

confi-guration dans laquelle, une fois les cellules pi´eg´ees, le flux dans les pi`eges seraient r´eduits au

minimum. Cela est possible en utilisant les chambres de mesure elles-mˆemes comme pi`eges, et

en utilisant les objets une fois pi´eg´es comme bouchon empˆechant tout flux. Ce concept a ´et´e

r´ecemment utilis´e par Tan et al. pour r´ealiser un travail tr`es int´eressant sur l’immobilisation et

la lib´eration s´elective de billes dans dans un r´eseau de pi`eges [115]. La configuration que nous

exposons pour le pi´egeage des cellules est similaire `a leur pi`ege `a billes, mais les g´eom´etries que

nous avons choisies sont contraintes par des consid´erations pratiques que nous expliciterons dans

la deuxi`eme partie de ce chapitre, li´ees `a l’utilisation de nos pi`eges comme chambre de mesure

´electrochimique.

Consid´erons un canal pr´esentant un r´etr´ecissement de telle sorte que les cellules d’int´erˆet

soient bloqu´ees. La pr´esence d’une ou plusieurs cellules bloqu´ees en amont de ce r´etr´ecissement

diminue grandement le flux `a travers le pi`ege. En ajoutant en entr´ee du pi`ege des canaux de

d´elestage, une fois les pi`eges remplis, le flux principal sera donc d´evi´e `a travers ces derniers

(figure 3.1).

De par son caract`ere clos, cette configuration convient particuli`erement `a l’int´egration dans

une plate-forme microfluidique d’analyse ´electrochimique de cellules. En effet, une fois pi´eg´ees,

les cellules ne seront plus perturb´ees par les flux. Il suffit ensuite de les maintenir en vie et de

les activer en faisant diffuser dans les chambres les produits n´ecessaires avant d’effectuer nos

mesures.

Nous avons r´ealis´e la simulation num´erique par ´el´ements finis des flux traversant une telle

configuration de microcanaux avec le logiciel COMSOL en utilisant l’outil correspondant `a la

dynamique des fluides, avec l’´equation de Navier-Stokes pour un fluide incompressible, en deux

dimensions. La figure 3.1 r´esume les r´esultats de la simulation, correspondant `a la configuration

en cul-de-sac additionn´ee d’un canal de d´elestage. La diminution de vitesse, due `a l’ajout d’un

obstacle devant le r´etr´ecissement, est de 26 fois. Le canal de d´elestage absorbe la diff´erence de

d´ebit. Il existe une relation de proportionnalit´e, donn´ee par les rapports de r´esistances fluidiques,

entre la vitesse en entr´ee du pi`ege et la vitesse dans le r´etr´ecissement. Pour s’assurer que les

cellules ne soient pas trop perturb´ees, il suffit de choisir la vitesse en entr´ee en cons´equence.

Contrˆole du nombre de cellules pi´eg´ees

Les param`etres caract´eristiques du pi`ege sont les dimensions du conduit bloquant les cellules

et la taille des chambres. Il suffirait que les dimensions du conduit soient inf´erieures au diam`etre

3.1. Un dispositif pour pi´eger des cellules 59

A B

140 20 0 (m/s) 40 60 80 100 120

Fig. 3.1 – Pi`ege `a cellule dans la configuration en cul-de-sac. La simulation par ´el´ements finis

d’un ´ecoulement de Stokes plan en 2 dimensions dans cette configuration, sans et avec un pilier

circulaire de 15 µm de diam`etre en guise de cellule pi´eg´ee, nous permet de jauger les vitesses

relatives entre les diff´erentes parties. Sont repr´esent´ees ici les distributions des vitesses dans les

deux conditions.

100 µm

Fig. 3.2 – Microphotographie de la premi`ere g´en´eration de dispositifs de positionnement

ex-ploit´es, dans lequel une solution contenant des cellules a ´et´e introduite, dans le sens NE-SO (de

en haut `a droite `a en bas `a gauche). Les canaux mesurent 40 µm de large et 30 µm de haut.

Malgr´e la grande section des canaux, les cellules et les d´ebris cellulaires s’accumulent dans les

parties `a faible d´ebit.

d’une cellule, estim´e `a 10µm, pour r´ealiser le pi`ege bloquant. Dans ce cas id´eal, une seule cellule

suffirait `a boucher le pi`ege. Cependant, la fabrication de dispositifs complexes de diff´erentes

hauteurs et de formes n’est pas ais´ee. De plus, la solution contenant les cellules est souvent pollu´ee

par des d´ebris cellulaires et divers ´el´ements s´ecr´et´es par les cellules en culture. Nombreuses sont

les sources de bouchage avant mˆeme que les cellules puissent se loger dans les pi`eges (figure 3.2).

Nous choisissons alors une m´ethode plus robuste, qui consiste `a fixer une dimension du

conduit `a environ 7 µm. Ceci permettra l’´evacuation plus facile des d´ebris et diminuera par

cons´equent la probabilit´e de trouver un pi`ege sans cellules. De ce fait, le conduit ne pouvant

plus ˆetre compl`etement bouch´e, il sera n´ecessaire de limiter les dimensions des chambres en

fonction du nombre de cellules voulu dans chaque pi`ege.

Dans le cas de pi`eges pour cellules uniques, les chambres auront des dimensions l´eg`erement

sup´erieures au diam`etre des cellules, ´evitant ainsi un trop grand confinement de ces derni`eres.

Il est `a noter qu’un flux r´esiduel ne pourra jamais ˆetre ´elimin´e dans cette configuration, et qu’il

sera n´ecessaire de concevoir les canaux de d´elestage de sorte que, une fois une cellule log´ee dans

le pi`ege, les suivantes soient emport´ees par le flux d´evi´e. Dans le cas de pi`eges pour cellules

multiples, ce probl`eme ne se pose pas.

Efficacit´e du pi´egeage

Dans le cas d’un dispositif de positionnement cellulaire destin´e `a contenir une grande quantit´e

de chambres permettant l’acc`es `a une grande quantit´e de donn´ees `a chaque manipulation, le fait

que tous les emplacements soient remplis est un pr´erequis.

Afin de s’assurer de l’efficacit´e maximale du pi´egeage, un ´equilibre entre le flux traversant le

pi`ege et le flux traversant les canaux de d´elestage doit ˆetre ´etabli. Du fait de l’´etranglement

per-mettant de pi´eger des cellules, le d´ebit dans le pi`ege est inexorablement plus faible que celui d’un

canal similaire sans ´etranglement. De plus, les canaux de d´elestage doivent permettre d’´evacuer

tous types de d´ebris ou d’amas cellulaires contenus dans la solution. Si la diff´erence de d´ebit

entre les deux types de canaux est trop grande d`es le d´epart, la probabilit´e de pi´eger une cellule

sera d’autant plus faible et, par cons´equent, les manipulations n´ecessaires au positionnement

cellulaire seront d’autant plus fastidieuses.

Comparons le d´ebit dans les deux types de canaux dans une configuration qui correspondrait

le plus au dispositif final. Nous pouvons effectuer un calcul approximatif pour d´eterminer le

rapport entre les deux d´ebits, le d´ebit dans le pi`egeQ

_p

et le d´ebit dans le canal de d´elestageQ

_d

.

L’expression exacte du d´ebitQdans un canal rectangulaire de hauteurh, de largeurwet de

longueurL est de [116, 117] :

Q= ^wh

3

12ηL^∆P

"

1−6^h

w

∞

X

n=0

λ

−5 n

tanh(λ

_n

^h

w⁾

#

avec λ

_n

= ^{(2n+ 1)π}

2 ^(3.1)

o`uη est la viscosit´e du fluide et ∆P est la diff´erence de pression appliqu´ee entre l’entr´ee et

la sortie du canal. Nous pouvons consid´erer en premi`ere approximation :

Q≃ ^wh

3

12ηL^∆P

·

1−^3.2

6

π

5

h

w

¸

(3.2)

Cette expression donne une erreur inf´erieure `a 10% pour

_w^h

<0,7.

Estimation du rapport de d´ebit entre un pi`ege et un canal de d´elestage

Le dispositif final aura une hauteur de canal fix´ee d’environ 20 µm pour avoir une assez

bonne proximit´e entre les cellules d’int´erˆet et les ´electrodes. Pour rester dans l’approximation

de l’´equation 2, nous choisirons pour largeur des canaux de d´elestage 30 µm. Nous fixerons de

plus leur longueur `a 120µm pour des raisons de g´eom´etrie.

L’expression approximative du d´ebit est lin´eaire par rapport `a la chute de pression dans le

canal et nous rappelle la loi d’Ohm pour les circuits ´electriques. Il est possible de d´emontrer

l’analogie entre la fluidique et l’´electronique o`u le d´ebit, la diff´erence de pression et le facteur que

l’on appellera la r´esistivit´e fluidique joueraient respectivement le rˆole du courant, de la tension

et de la r´esistivit´e ´electrique [118]. Nous adopterons sans le d´emontrer le fait que les r´esistivit´es

fluidiques de canaux en s´erie s’additionnent.

La source de r´eduction de d´ebit dans le pi`ege provient du r´etr´ecissement bloquant les

cel-lules et du canal r´esultant (figure 3.1). La r´esistivit´e fluidique des parties en amont et en aval

du r´etr´ecissement sont n´egligeables devant celle du r´etr´ecissement. Prenons comme estimation

grossi`ere que le r´etr´ecissement et le petit canal r´esultant ont pour r´esistivit´e fluidique celle d’un

simple canal de 7 µm de haut, 20 µm de large et 10µm de long. Cela donne alors un rapport

des d´ebits de

^Qp

3.1. Un dispositif pour pi´eger des cellules 61

Max 148 Min 0 140 60 0 20 40 80 100 120 Champ de vitesse surfacique (m/s)

50 µm

Fig.3.3 – Une maille du r´eseau de pi`eges `a cellules. Le sens de l’´ecoulement se fait de gauche `a

droite. Une intersection en T permet la division du flux de part et d’autre du pi`ege. Les petites

dimensions du pi`ege ainsi que du petit canal qui le relie au reste de l’´ecoulement procurent une

grande r´esistance `a ce chemin fluidique et empˆechent tout flux, une fois une cellule est pi´eg´ee,

voir partie de droite. Seules les cellules qui ´etaient parfaitement au centre du canal en entr´ee

auront une probabilit´e non nulle d’ˆetre pi´eg´ees.

Pour toutes modifications dans la conception, il sera important de prendre en compte cette

restriction sur l’efficacit´e du pi´egeage.

3.1.3 Simulation et visualisation des lignes de courant

Simulation de la r´epartition du d´ebit

Les consid´erations pr´ec´edentes ont pos´e les traits principaux de la structure d’un dispositif

de positionnement cellulaire. Il s’agit maintenant d’appliquer cette structure dans un dispositif

parall´elis´e. Nous avons alors r´epliqu´e ces pi`eges selon un r´eseau pr´ed´efini. Ce r´eseau correspond

en fait au r´eseau de micro´electrodes que nous avons d´evelopp´e pour l’exp´erience. Ce r´eseau est

un r´eseau carr´e `a 36 emplacements, dont le pas est 200µm.

Chaque maille du r´eseau est centr´ee sur l’emplacement o`u la ou les cellules seront pi´eg´ees.

Nous avons simul´e num´eriquement les flux dans l’unit´e de base illustr´ee par la figure 3.3. Pour

cela, nous avons utilis´e le logiciel COMSOL de simulation num´erique par ´el´ements finis, avec

l’outil _«dynamique des fluides_» et l’´equation de Navier-Stokes pour un fluide incompressible,

en deux dimensions.

Dans le cas pr´esent, la chambre de mesure a une largeur de 15µm, ´equivalente `a une chambre

de capture de cellules uniques. Le r´etr´ecissement est plus petit que dans le calcul pr´ec´edent, large

de 3µm afin de capturer des cellules d’environ 5µm de diam`etre. Avec des canaux de d´elestage

de largeur principale de 20 µm, nous obtenons une variation du rapport des d´ebits

^Qp

Qd

passant

de 4,5% `a 0,05% avant et apr`es la capture d’une cellule. Un si faible rapport apr`es qu’une cellule

soit log´ee dans le pi`ege nous assure la capture de cellules uniques puisque la chance qu’une cellule

soit entraˆın´ee dans le pi`ege par le courant diminue avec le d´ebit.

50 µm

Fig. 3.4 – Microphotographie du flux de particules fluorescentes dans un dispositif de pi`eges `a

cellules. Les traˆın´ees blanches correspondent au trajet des particules. Le dispositif est con¸cu de

la mˆeme mani`ere que celui de la simulation pr´ec´edente, mais les tailles des canaux, 40 µm de

largeur, sont diff´erents.

Lignes de courant

Les ´etapes de fabrication d’un tel dispositif pouvant ˆetre nombreuses, il est n´ecessaire

d’effec-tuer des v´erifications en fin de parcours pour valider le moule. Pour s’assurer rapidement du bon

fonctionnement d’un dispositif contenant une grande quantit´e de canaux, nous y introduisons

des particules fluorescentes. Lors de la prise de microphotographie, avec un temps de pose

cor-respondant approximativement au temps de parcours moyen d’une particule sur 100 µm, dans

un montage sp´ecial pour la fluorescence, le chemin parcouru par la particule sera enregistr´e sous

forme de traˆın´ee (figure 3.4).

3.2 Gestion du milieu fluidique des pi`eges

Une fois le positionnement des cellules effectu´e, il reste `a pr´eparer les cellules pour la mesure.

Pour cela, la gestion des flux dans le dispositif est primordiale.

3.2.1 Le principe des chambres de mesure

Les signaux ´emis par les cellules sous forme de s´ecr´etion d’esp`eces ´electroactives sont le plus

souvent intenses mais tr`es localis´es. Ainsi, il est n´ecessaire de placer les instruments de mesure au

plus proche des membranes cellulaires afin de ne pas diluer les mol´ecules dans le milieu, au risque

de noyer le signal dans le bruit ambiant. La stabilit´e de l’environnement dans les chambres de

mesure n´ecessaire pour le maintien des cellules au niveau de stress minimal contribue ´egalement

au bon d´eroulement des mesures puisqu’elle empˆeche les flux parasites de perturber le milieu.

Cependant, positionner les cellules dans les chambres ne suffit pas aux mesures

´electrochi-miques dans un tel dispositif. L’int´erˆet de la microfluidique est le contrˆole actif de

l’environne-ment, nous devons ˆetre en mesure de contrˆoler pr´ecis´ement les changements de milieu dans les

3.2. Gestion du milieu fluidique des pi`eges 63

frais pour la survie des cellules d’une part, et `a injecter des compos´es chimiques pour activer les

cellules avant les mesures d’autre part.

´

Etant donn´e la petite taille des chambres de mesure et la n´ecessit´e d’un environnement stable,

l’apport d’´el´ements nutritifs ou d’activateurs chimiques pourra se faire par transport diffusif des

mol´ecules. Dans le souci de minimiser le flux dans les chambres de mesure tout en contrˆolant

l’efficacit´e du renouvellement du milieu, nous modifions le dessin et l’utilisation du dispositif de

positionnement cellulaire. Le flux traverse d´esormais le dispositif perpendiculairement au flux

permettant la capture des cellules, passant devant l’entr´ee des pi`eges sans pouvoir les traverser.

Les ´echanges de mol´ecules pourront se faire grˆace au flux constant de milieu frais `a l’entr´ee du

pi`ege, et ce, ind´ependamment de la vitesse impos´ee au liquide.

3.2.2 Renouvellement du milieu des chambres de mesure

Comme toute unit´e du vivant, la cellule puise de son milieu environnant ce dont elle a besoin

pour survivre et transforme ces ´el´ements nutritifs de base en ´energie, en produits n´ecessaires

`a son activit´e et en d´echets. Pour un milieu clos et stable, l’environnement autour de la

cel-lule s’appauvrit au fur et `a mesure en ´el´ements nutritifs et s’enrichit en esp`eces toxiques. Le

renouvellement r´egulier, voire constant, du milieu est donc n´ecessaire. Voici la composition des

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