Conclusion

1.1. Particularit´es de la lithographie molle en microfluidique 27

1.1 Particularit´es de la lithographie molle en microfluidique

1.1.1 D´efinition

La lithographie molle, plus connue en anglais parsoft lithography, est une strat´egie de

micro-fabrication destin´ee `a fabriquer ou reproduire des structures `a partir de moules et de tampons

en ´elastom`ere, c’est `a dire faits `a partir de polym`eres pr´esentant des propri´et´es ´elastiques. Nous

utilisons plus particuli`erement la technique d’_«empreinte par moulage_», REM - replica

mol-ding [29], pour fabriquer nos dispositifs microfluidiques. Cette technique consiste `a mouler un

monom`ere polym´erisable sur une surface microstructur´ee pour former une empreinte de ces

structures sur l’´elastom`ere polym´eris´e. Il s’en suit l’assemblage du bloc d’´elastom`ere sur un

sub-strat choisi. L’interstice cr´e´e entre le subsub-strat et l’empreinte des structures dans l’´elastom`ere

correspond alors aux canaux microfluidiques (figure 1.1).

A

B D

C

Fig. 1.1 – Fabrication d’un dispositif microfluidique en PDMS. A. Fabrication d’un moule

par les techniques de photolithographie `a partir d’un masque transparent. B. Moulage de

l’´elastom`ere sur le moule. C. Apr`es d´emoulage de l’´elastom`ere r´eticul´e, les entr´ees et sorties

fluidiques sont cr´e´ees. D. Assemblage du dispositif sur son substrat.

Le mat´eriel n´ecessaire est minimal : monom`ere, moules, montages pour la polym´erisation

de l’´elastom`ere et pour l’assemblage des dispositifs. La polym´erisation et le traitement pour

l’assemblage peuvent ˆetre aussi simples qu’un passage dans un four et une oxydation des

sur-faces. La fabrication en s´erie de ces dispositifs ne n´ecessite aucune expertise ni machinerie

so-phistiqu´ee. Cet attribut d´emarque la lithographie molle des autres techniques de fabrication

de microsyst`emes. En effet, les autres mat´eriaux habituels pour les microsyst`emes sont le

sili-cium [30, 31], le verre [32], et le plastique [33]. Dans le premier cas, les ´etapes de fabrication et

d’assemblage sont longues et souvent tr`es techniques, consistant en plusieurs ´etapes de

photo-lithographie et de gravure successives et n´ecessitant un personnel d´edi´e. Pour les dispositifs en

verre, seules les structures tr`es simples peuvent ˆetre fabriqu´ees. Enfin, dans le cas du plastique,

la probl´ematique est quelque peu diff´erente puisque le principe de fabrication est aussi celui de

la r´eplique d’un moule. L’avantage de l’utilisation d’´elastom`eres r´eside alors dans les propri´et´es

intrins`eques du mat´eriau et dans leur facilit´e `a ˆetre manipul´es. Ce point sera amplement d´etaill´e

dans le paragraphe suivant. Notons cependant que le silicium et mˆeme le plastique b´en´eficient

d’avantages importants par rapport aux ´elastom`eres en ce qui concerne l’industrialisation. Le

silicium, tout particuli`erement, est usin´e par les techniques de microfabrication plus pr´ecises et

tr`es largement implant´ees dans les industries.

Les coˆuts et difficult´es li´es `a la lithographie molle r´esident seulement dans l’obtention ou

la fabrication des structures qui serviront de moule. La fabrication des moules se fait avec les

techniques usuelles de photolithographie (voir Annexe A), et les efforts mis en œuvre pour

l’ob-tention des moules sont ´equivalents `a ceux n´ecessaires pour le d´eveloppement des autres types

de dispositif. Les avantages de la lithographie molle apparaissent seulement ensuite, dans la

fabrication ais´ee de prototypes en grand nombre. Leur validation ou invalidation est facilit´ee, ce

qui, en retour, acc´el`ere le processus de d´eveloppement et d’optimisation par essai/erreur. Enfin,

une fois un dispositif valid´e, sa fabrication et son utilisation deviennent ind´ependantes du

labo-ratoire de d´eveloppement et peut se faire avec commodit´e dans n’importe quel environnement.

C’est pour ces raisons que les dispositifs d´evelopp´es par lithographie molle sont de plus en plus

utilis´es dans les divers laboratoires scientifiques ou exploit´es par les industriels.

1.1.2 PDMS

Les polym`eres en g´en´eral, plastiques ou ´elastiques, sont plus facile `a fabriquer et assembler

que le verre ou le silicium, mais ils pr´esentent n´eanmoins quelques d´esavantages. Le contrˆole

de leur ´etat de surface demande une attention particuli`ere, plus complexe que pour le verre

ou le silicium. De plus, ils sont souvent incompatibles avec les solvants organiques, et sont

g´en´eralement incompatibles avec les hautes temp´eratures.

Pour la lithographie molle, les mat´eriaux les plus souvent utilis´es sont le Polyur´ethane,

le Fluorosilicone ou autres polym`eres silicon´es. Pour les applications biologiques, souvent en

solution aqueuse, tous les mat´eriaux cit´es pr´ec´edemment peuvent ˆetre utilis´es, mais le mat´eriau

de choix est le PDMS - polydim´ethylsiloxane, un polym`ere organique silicon´e transparent, inerte

et non toxique.

R´eticulation du PDMS

La formule chimique du PDMS est la suivante : (H

3

C) [SiO(CH

3

)

2

]

_n

CH

3

. La figure 1.2 donne

la formule semi-d´evelopp´ee du PDMS ainsi que la r´eaction de r´eticulation. Le PDMS utilis´e au

laboratoire, RTV 615, se pr´esente sous forme d’un produit bicomposant A et B, o`u A correspond

au polym`ere de base et B correspond `a l’agent de r´eticulation. Ce dernier est compos´e de

chaˆınes courtes du polym`ere de base o`u les groupements terminaux vinyles sont remplac´es par

un groupement m´ethyle. La r´eaction de r´eticulation peut se faire `a temp´erature ambiante en

une journ´ee, mais est acc´el´erable `a chaud : le temps de prise compl`ete peut ˆetre r´eduit `a une

heure `a 150

◦

C. La r´eaction peut ˆetre de surcroˆıt acc´el´er´ee par l’addition d’un sel de platine.

Nous laissons habituellement la r´eaction se faire pendant deux heures `a 80

◦

C.

Modification des propri´et´es de surface

Une fois pris, le bloc de PDMS pr´esente une surface hydrophobe. La chimie de surface peut

ˆetre contrˆol´ee par des m´ethodes bien d´evelopp´ees [34], notamment celle de l’introduction de

groupes polaires de type silanol (Si - OH) au d´etriment des groupements m´ethyles (Si -CH

3

)

par exposition de la surface `a un plasma `a air [35]. De plus, par ses propri´et´es de surface et

sa flexibilit´e m´ecanique, le PDMS peut adh´erer `a une surface relativement plane par contact

1.1. Particularit´es de la lithographie molle en microfluidique 29

Fig.1.2 – R´eticulation du PDMS. en haut : Formule semi-d´evelopp´ee du polym`ere de base et

de l’agent de r´eticulation. en bas : R´eticulation du PDMS

conforme, en ´epousant parfaitement la surface du substrat. Il peut alors pallier les d´efauts

mineurs de plan´eit´e de la surface grˆace aux interactions van der Waals cr´e´es `a l’interface. Ce

contact conforme est r´eversible et une d´eformation du bloc de PDMS permet de le d´ecoller de la

surface plane. Lorsque la surface de PDMS est oxyd´ee par le plasma, et que le bloc de PDMS est

en contact conforme avec un substrat, il peut se produire des r´eactions de condensation entre les

groupements silanol (Si - OH) et les groupements appropri´es (OH, COOH, C=O) du substrat.

Les liaisons covalentes r´esultantes contribuent `a l’adh´esion irr´eversible du bloc de PDMS sur le

substrat.

Il est possible de faire adh´erer ainsi le PDMS sur des substrats de diff´erentes natures [34] :

PDMS, verre, silicium, silice (SiO

2

), quartz, nitrure de silicium (Si

3

N

4

), poly´ethyl`ene,

poly-styr`ene et carbone vitreux. Cependant, cette m´ethode n’est pas efficace sur tous les polym`eres.

Le PDMS ne peut s’assembler de cette mani`ere sur les substrats suivants : Saran, polyimide,

poly(m´ethylmethacrylate) et polycarbonate.

Enfin, l’hydrophilie cr´e´ee par le plasma disparaˆıt au bout de quelques heures du fait du

r´earrangement des chaˆınes de polym`ere au sein du bloc de PDMS [36]. Elle peut n´eanmoins ˆetre

conserv´ee plus longtemps si cette surface est maintenue au contact d’une solution polaire ou si

un traitement de surface par greffage de mol´ecules est effectu´e [34].

Avantages du PDMS par rapport aux les polym`eres plastiques

Le PDMS polym´eris´e est une mati`ere ´elastique tr`es facile `a manipuler, couper ou trouer. Il

retrouve sa forme apr`es la plupart des d´eformations m´ecaniques et permet un d´emoulage facile

sans risque d’abˆımer le moule qui repr´esente le coˆut de fabrication le plus important. La r´eplique

de structures `a l’´echelle de la centaine de nanom`etres a ´et´e r´ealis´ee avec grande fid´elit´e [37]. De

surcroˆıt, le PDMS est consid´er´e comme optiquement transparent jusqu’`a 280 nm, ce qui le rend

A

B

C

Moule Substrat plan

Fig. 1.3 – Lithographie molle multicouche, adapt´ee de [38, 40, 39]. A. L’assemblage de blocs

d’´elastom`eres pr´ealablement moul´es permet la superposition de r´eseaux de canaux. L’espacement

entre chaque r´eseau de canaux correspond `a l’´epaisseur de la couche du bas, `a l’´epaisseur d’un

canal pr`es. B. Une membrane de 50 µm d’´epaisseur de PDMS contenant des ouvertures de

100µm. C. En reprenant le sch´ema A, l’utilisation d’une couche inf´erieure fine contenant des

ouvertures au-dessus des canaux permet, apr`es l’assemblage du bloc d’´elastom`ere sup´erieur sur

la membrane trou´ee, la r´ealisation d’un r´eseau de canaux interconnect´es en trois dimensions.

Ceci permet la circulation des fluides dans des r´eseaux de canaux en trois dimensions.

compatible avec de nombreuses m´ethodes de d´etection, notamment la mesure d’absorbance en

UV/visible ou en fluorescence. Enfin, le PDMS est biologiquement inerte, perm´eable `a l’air et

st´erilisable `a haute temp´erature. Ceci rend possible la culture cellulaire ainsi que la manipulation

de cellules vivantes dans les dispositifs constitu´es de ce mat´eriau. Toutes ces propri´et´es font

du PDMS un mat´eriau de choix pour les dispositifs microfluidiques d´edi´es `a l’analyse et la

manipulation d’´echantillons biologiques.

1.1.3 Lithographie molle _«multicouche_»

Les dispositifs fabriqu´es par lithographie molle sont par nature r´epartis sur un seul et mˆeme

niveau, rendant difficile l’introduction d’´el´ements actifs ou mobiles, et empˆechant la formation

de structure en trois dimensions d´evelopp´ee. Pour pallier ces difficult´es, la lithographie molle

multicouche, oumulti-layered soft lithography[38], a ´et´e d´evelopp´ee dans un premier temps par

le groupe de S. Quake. Cette technique consiste en la superposition et l’assemblage irr´eversible

de plusieurs couches de dispositifs fabriqu´es par lithographie molle (figure 1.3 A). La facilit´e

de leur assemblage ´etanche a permis une ouverture vers la verticale des dispositifs

microflui-diques en ´elastom`ere. Il est d´esormais possible de fabriquer des dispositifs de plusieurs couches

avec la mˆeme aisance que ceux fabriqu´es par la technique standard de lithographie molle.

Pa-rall`element, l’´equipe de G. M. Whitesides a d´evelopp´e une technique similaire pour cr´eer des

canaux microfluidiques en trois dimensions [39]. Celle-ci consiste en l’assemblage irr´eversible

d’un bloc d’´elastom`ere moul´e par lithographie molle par dessus une membrane de ce mˆeme

1.1. Particularit´es de la lithographie molle en microfluidique 31

A B

Fig. 1.4 – D´eformation d’une membrane de PDMS entre un canal de contrˆole et un canal

fluidique (de profil rectangulaire A., et arrondi B.), adapt´e de Unger 2000

´elastom`ere structur´e et trou´e par une technique de lithographie molle l´eg`erement modifi´ee. La

connexion entre les deux couches se fait grˆace aux trous de la membrane (figure 1.3 B et C).

L’int´erˆet principal de la lithographie molle multicouche r´eside dans l’int´egration d’´el´ements

de contrˆole actif dans une puce microfluidique. Ceci est rendu possible par la flexibilit´e des

´elastom`eres. Le module de Young de tels mat´eriaux est d’environ 700 kPa, permettant une

grande d´eformation de ce mat´eriau par une force d’actionnement minimale. Il existe diff´erentes

m´ethodes pour provoquer la d´eformation d’une membrane d’´elastom`ere fix´ee par son p´erim`etre.

Un premier exemple est celui du dispositif ´electromagn´etique ´elastom´erique [41]. En effet, il

est possible d’imposer des propri´et´es magn´etiques ou ´electriques `a une membrane d’´elastom`ere

grˆace `a l’adjonction respective de poudre de fer ou de particules de noir de carbone. Cependant,

la m´ethode la plus simple et directe est d’utiliser la membrane d’´elastom`ere non modifi´ee et de

lui appliquer une pression `a sa surface. Sa d´eformation sera d’autant plus importante que le

rapport entre ses deux plus petites dimensions (

^´epaisseur_largeur

) est faible.

L’application de ce ph´enom`ene dans un dispositif fabriqu´e par lithographie molle multicouche

est relativement ais´ee. Il suffit que les deux niveaux de r´eseau microfluidique soient s´epar´es par

une fine couche d’´elastom`ere (figure 1.3 A), ce qui se retrouve syst´ematiquement lorsqu’une

couche d’´elastom`ere structur´ee est assembl´ee sur une deuxi`eme couche d’´elastom`ere structur´ee

de tr`es faible ´epaisseur. Imaginons donc un canal de la couche de faible ´epaisseur. En supposant

que la couche d’´elastom`ere a ´et´e fix´ee `a 20 µm et que le canal a une hauteur de 10 µm, il

existe alors une membrane d’´elastom`ere de 10µm d’´epaisseur suspendue au-dessus de toute la

surface du dit canal. Si un bloc entier d’´elastom`ere est assembl´e par dessus la premi`ere couche

fine, la membrane disparaˆıtra et fera partie int´egrante de la masse d’´elastom`ere rajout´ee. Si,

par contre, le bloc d’´elastom`ere assembl´e contient un canal, au croisement de ce canal avec celui

de la couche fine, il restera une portion de la membrane de 10 µm qui ne sera pas coll´ee au

bloc d’´elastom`ere rajout´e (figure 1.3 A). Ainsi, cette membrane sera simultan´ement au contact

du fluide circulant dans le canal du bas, canal de la fine couche initiale, et du fluide circulant

dans le canal du haut, canal de la couche rajout´ee. La distorsion de cette membrane est de fait

contrˆol´ee par la diff´erence de pression entre les deux canaux. Selon la g´eom´etrie et la diff´erence

de pression, il est possible de d´eformer la membrane de telle sorte que l’un des canaux soit

totalement obtur´e [38] (figure 1.4). Cette configuration est celle d’une vanne microfluidique.

C’est ainsi que sont introduits divers ´el´ements de contrˆole actif tels que les vannes, les pompes

p´eristaltiques et les m´elangeurs. La commande de ces ´el´ements de contrˆole actif peut se faire

au travers d’un syst`eme de commande de pression contrˆol´e par ordinateur grˆace `a une s´erie

d’´electrovannes. Les d´etails de fabrication de tels ´el´ements sont explicit´es en annexe A.

La diff´erence fondamentale entre la lithographie molle et les autres techniques de

microfa-brication peut ˆetre r´esum´ee en deux points :

– La fabrication des dispositifs par lithographie molle, une fois le moule achev´e, est tr`es facile

et tr`es rapide. Ceci permet la fabrication ais´ee des prototypes en grand nombre et donc

facilite leur exploitation et leur validation ou invalidation. Le processus du d´eveloppement

se retrouvent alors grandement acc´el´er´e et l’utilisation des dispositifs rendue plus accessible

pour les non-sp´ecialistes.

– L’utilisation d’´elastom`eres permet l’int´egration d’´el´ements de contrˆole actif au sein des

dispositifs. Ceci permet la conception de microsyst`emes sophistiqu´es tout en conservant la

facilit´e et la rapidit´e dans leur fabrication.

1.2 D´eveloppement de dispositifs int´egr´es

Durant les ann´ees 1990, les efforts de recherche dans le domaine des microsyst`emes

ap-pliqu´es `a la biologie se sont concentr´es sur le d´eveloppement d’instruments d’analyse et de

d´etection biochimiques miniaturis´es et am´elior´es. Le changement d’´echelle a en effet augment´e

les sensibilit´es de d´etection, tout en r´eduisant les temps d’analyse et les quantit´es de r´eactifs

utilis´es. L’application de tels capteurs touche de nombreux domaines : la recherche

fondamen-tale en biologie [42, 43], la d´etection chimique pour l’environnement [44, 45], les diagnostiques

cliniques [46, 47] et les industries agro-alimentaire, pharmaceutique [48, 49] et de d´efense [50].

Cependant, les prouesses techniques r´ealis´ees par ces microsyst`emes n’ont pas particuli`erement

r´evolutionn´e la mani`ere de concevoir les exp´erimentations en recherche biologique. Ceci peut

s’expliquer par le trop grand ´ecart technique entre la machinerie utilis´e sur paillasse et ces

microsyst`emes, ainsi que le trop grand ´ecart culturel entre les utilisateurs et les concepteurs.

La lithographie molle a contribu´e `a un important changement dans ce domaine. L’aisance de

fabrication des dispositifs a consid´erablement r´eduit le temps et les coˆuts n´ecessaires, rendant

la technique accessible `a de nombreux chercheurs, mˆeme non sp´ecialistes. Parall`element, de plus

en plus de projets de recherche traitent de sujets pluridisciplinaires : il n’est donc plus rare de

trouver des physiciens et des th´eoriciens dans les laboratoires de biologie comme de trouver des

biologistes dans des laboratoires de physique ou de chimie. Avec l’att´enuation de ces fronti`eres,

il s’est d´evelopp´e au fil des ann´ees de v´eritables ´echanges, centr´es sur ces techniques nouvelles.

De plus, la possibilit´e d’int´egrer des ´el´ements actifs de contrˆole fluidique grˆace aux vannes

pneumatiques a permis la conception et l’examen de syst`emes complexes int´egrant chambres

de r´eaction, ´el´ements de d´etection et de s´eparation au sein d’un mˆeme dispositif. Le champ

d’application s’en est grandement ´elargi, et les possibilit´es semblent illimit´ees.

La recherche dans ces domaines continue d’´evoluer et de nombreuses alternatives `a la

litho-graphie molle multicouche se sont d´evelopp´ees. Le PDMS n’est plus le seul mat´eriau utilis´e pour

les dispositifs microfluidiques aux applications biologiques et les ´el´ements de contrˆole actif de

ses dispositifs sont d´esormais vari´es, allant des vannes pneumatiques hybrides en ´elastom`eres

modifi´es r´esistants aux solvants organiques [51] aux compressions m´ecaniques externes avec des

syst`emes de plage Braille [52]. Cependant, la lithographie molle demeure aujourd’hui encore un

outil de d´eveloppement de microsyst`emes pour les applications biologiques extrˆemement puissant

et utile, par sa polyvalence, sa capacit´e `a int´egrer divers ´el´ements et sa popularit´e grandissante

dans les laboratoires de biologie.

1.2.1 Exemple de d´eveloppement d’un dispositif int´egr´e

Pour illustrer le processus de d´eveloppement de dispositifs int´egr´es bas´es sur la lithographie

molle, retra¸cons les ´etapes cl´es qui ont abouti `a la r´ealisation d’une plate-forme multiplexe de

1.2. D´eveloppement de dispositifs int´egr´es 33

synth`ese d’ADN compl´ementaires `a partir d’ARN messagers extraits d’une cellule unique

(plate-forme multiplexe de RT-PCR) [53]. Le but d’une telle plate-(plate-forme est d’obtenir des informations

exhaustives sur l’expression g´en´etique d’une cellule unique, tout en gardant au sein de la mˆeme

exp´erience un aspect statistique indispensable `a l’interpr´etation des r´esultats obtenus. Cette

approche aurait paru irr´ealiste il y a dix ans, devant l’importance des obstacles `a franchir, mais

elle est aujourd’hui presque habituelle. La cl´e de voˆute de cette approche est l’analogie entre

un dispositif microfluidique et un circuit ´electronique o`u chaque ensemble peut ˆetre subdivis´e

en entit´es ´el´ementaires et simples, comme les transistors, les compteurs, les comparateurs, les

multiplexeurs... Il est alors toujours possible de d´evelopper s´epar´ement chacun des ´el´ements

dans le but final de les int´egrer dans un seul dispositif pour accomplir une tˆache sp´ecifique.

C’est cette flexibilit´e retrouv´ee dans la lithographie molle qui permet d’envisager les projets les

plus invraisemblablesa priori.

Nous allons d´etailler ici les entit´es ´el´ementaires simples qui permettent de rassembler

diff´e-rents ´el´ements fonctionnels dans un dispositif int´egr´e. Pla¸cons-nous dans le cadre d’un dispositif

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