Treize échantillons congelés de tumeurs fibreuses solitaires méningées de patients opérés à la Pitié Salpêtrière (cf Partie I) sont récupérés à la tumorothèque locale après validation par le comité scientifique d’OncoNeuroThèque et la fusion des gènes NAB2-STAT6 est recherchée par séquencage ADN. Ces tumeurs ont été recontrôlées en anatomopathologie et l’immunomarquage nucléaire Stat6 était positif.
Le travail de séquençage et de génération du virus RCAS a été réalisé par l’équipe de vectorologie de l’ICM (Andre Sobczyk). Après extraction de l’ARN tumoral des tumeurs congelées de patients, le cDNA du gène de fusion NAB2-STAT6 est synthétisé. L’objectif est de choisir deux transcrits de fusion de taille compatible avec l’insertion dans le vecteur RCAS (2.0-2.5 kb), ce qui reste le cas dans la plupart des TFS d’après les données de la littérature52,139, l’un avec un profil indolent et l’autre plus agressif, d’après les données connues pour les TFS. Les transcrits de fusion seront associés à un tag flag. Nous disposons également d’un virus RCAS porteur du gène de la GFP (green-fluorescent protein), et d’un virus RCAS porteur d’un tag Flag (épitope DYKDDDDK) dans le vecteur RCAS vide (RCAS-X) synthétisé par la plateforme de vectorologie. Le vecteur RCAS est un don du Dr N. Lindberg (Uppsala, Suède). Dans les treize échantillons, douze ont mené à l’identification d’une fusion, et deux gènes de fusion différents ont été identifiés et donc choisis pour générer deux virus RCAS différents :
• RCAS16 : synthétisé à partir de la fusion NAB2exon2-STAT6exon16 (retrouvée dans 11 cas)
• RCAS17 : synthétisé à partir de la fusion NAB2exon6-STAT6exon17 (retrouvée dans un cas)
Notons qu’il est cohérent, d’après les données de la littérature, d’avoir retrouvé ces deux fusions, puisque les fusions du type NAB2exon4-STAT6exon2 sont majoritairement retrouvées dans les tumeurs pleurales, tandis que les fusions avec STAT6 tronqué, comme NAB2
84 Les RCAS sont fournis aux concentrations suivantes :
• RCAS-X : 1 microgramme/microlitre ; • RCAS 16 : 2,15 microgrammes/microlitre ; • RCAS 17 : 2,02 microgrammes/microlitre ; • RCAS GFP : 3,7 microgrammes/microlitre.
Les séquences ADN complètes des deux gènes de fusion inclus dans les RCAS, ainsi que la structure des virus sont présentés en annexe.
b) P
RODUCTION DU VIRUSRCAS
ET CONTROLE PARW
ESTERN-B
LOTDes fibroblastes immortalisés de poulet DF1 sont mis en culture dans un milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ; Gibco/ Invitrogen) + 10% SVF (Serum de Veau Fœtal) et incubés à 37° dans une boîte de 10cm non supplémenté.
Lorsque les cellules sont à 20%-40% de confluence dans une flasque T25, les cellules sont transfectées par l’un des virus RCAS selon le protocole suivant :
- retirer le milieu de culture pour le remplacer par du DMEM seul
- pour chaque virus (RCAS-X ou RCAS-GFP ou RCAS16 ou RCAS17) préparer une solution de 300 microlitres de DMEM + 9 microgrammes de virus + 18 microlitres de Xtreme Gene 9 transfection reagent (Sigma)
- laisser reposer à température ambiante 15 minutes
- déposer goutte à goutte cette solution dans la boite de culture contenant les cellules avec le DMEM seul
- conserver le même milieu tant que les cellules ne sont pas à confluence, de façon à permettre une infection de toutes les cellules par les cellules voisines lorsqu’elles commencent elles aussi à produire le virus
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Cette méthode de production de RCAS est celle utilisée par l’équipe d’Holland pour la génération de gliomes, de médulloblastomes et d’épendymomes66,67,116,133 et suit le protocole couramment utilisé dans la littérature4,5.
Afin de vérifier la production de protéines virales nous effectuons un contrôle par Western-blot. Les cellules à confluence sont décrochées de la boite de culture par trypsination 3 minutes à 37°. Elle sont récoltées puis centrifugées et resuspendues dans du PBS1X, après une seconde centrifugation on retire le surnageant et le culot de cellules est congelé « à sec » à -80°c. L’extraction des protéines se fait dans un second temps grâce au kit BCA (BCA protein assay kit, Perbio, 23227) en suivant le protocole fourni par le commercial. La quantité de protéines extraites est évaluée par dosage colorimétrique en plaque 96 puits à 550nm.
Le Western-blot est réalisé selon le protocole de l’équipe :
- on dépose 60µg de protéine dans un tube eppendorf, avec 25% de tampon NuPAGE
LDS sample Buffer (Life Technologie, NP007) + 5% de 2-βmercaptoethanol (Sigma,
M3148), que l’on complète avec de l’eau pour obtenir 24µl de solution
- ces solutions protéiques sont chauffées à 85°C pendant 5 minutes, centrifugées, puis déposées pour la migration dans les puits du gel d’acrylamide avec un marqueur de taille utilisé est Odyssey Li-Cor (928-40000). Le tampon de migration est composé de tampon 20X (NuPAGE MOPS SDS running buffer, Life Technologies NP0002) dilué a 1X. - les échantillons migrent environ 1h15 à 150V
- Le transfert se fait dans du tampon de transfert 10X (Pierce 35040) dilué à 1X sur une membrane de nitrocellulose (Protran BA85, Sigma z670987) pendant environ 1h15 à 300mA
- Les sites non spécifiques qui pourraient gêner la révélation sont saturés avec du tampon de blocage (Blocking buffer, Thermo Scientific 37535) pendant 1h à température ambiante sous agitation douce
- la membrane est incubée dans du TBS1X-Tween-20 0,1% avec l’anticorps primaire anti-Flag de lapin dilué au 1/1000 (Sigma F7425) et avec l’anticorps anti-bêta-actine de souris à 1/5000 (Abcam 8226) sur le nuit à 4°C, ou bien avec l’anticorps anti-Flag souris
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à 1/2500 (Sigma F3165) et avec l’anticorps polyclonal anti-cycloB de lapin à 1/2000 (Thermo Fisher 11859140)
- la membrane est rincée 20 minutes dans une solution de TBS 1X (Sigma T5912) + Tween-20 0,1% (Sigma P1379)
- puis incubée avec l’anticorps secondaire Odyssey anti-lapin 1/5000 (ScienceTec 92632211) et anti-souris 1/5000 (ScienceTec 92632210) pendant 1h à température ambiante
- la membrane est ensuite rincée avec du TBS1X-Tween-20 0,1%
- la membrane est imagée sur l’appareil Odyssey afin de révéler les marquages, et les différentes protéines identifiées en fonction de leur poids (Figure 3.2).
Protéine recherchée Taille (AA) Poids protéique (kDa)
RCAS-X - Pas de flag
RCAS16 : NAB2exon2-STAT6exon16 766AA 83.0 kDa
RCAS17 : NAB2exon6-STAT6exon17 717AA 77.3 kDa
NAB2 525 AA 56.6 kDa
Bêta-actine 375 AA 42.0 kDa
CycloB 193 AA 21.2 kDa
FIGURE 3.2:POIDS MOLECULAIRES DES PROTEINES DETECTEES EN WESTERN-BLOT