1. PRELEVEMENT ET CULTURE D’ARACHNOÏDE ET DE DURE-MERE
Les souris sont euthanasiées au CO2 selon le protocole en vigueur à l’animalerie et validé par le comité éthique. Les prélèvements sont réalisés en post mortem immédiat sous microscope binoculaire après une craniectomie étendue et une laminectomie cervicale. On commence par
87
prélever la méninge de la convexité crânienne (Figure 3.3a) puis le cerveau est soulevé (Figure 3.3b) de façon à exposer les nerfs crâniens, les vaisseaux de la base du crâne et le feuillet arachnoïdien qui est prélevé en monobloc (Figure 3.3c). Les prélèvements sont éventuellement transportés dans leur milieu de culture dans un tube stérile.
Les cultures cellulaires et tous les traitements effectués sur les cellules sont réalisés dans une pièce de culture L2 stérile, sous une hotte à flux laminaire vertical à la plateforme de culture cellulaire de l’ICM. Les cellules sont cultivées dans une étuve à 37°C, en atmosphère humide contenant 5% de CO2. Le protocole de culture est celui utilisé par l’équipe. Après le prélèvement du tissu arachnoïdien de la convexité et de la base du crâne, il est coupé en petits fragments à l’aide d’instruments de microchirurgie puis il est placé dans les puits d’une plaque de culture 6 puits contenant de la collagénase à la concentration de 0,02mg/ml. Après une période initiale de digestion de 2 heures à 37°C, on rajoute 1.5ml de milieu de culture composé de : DMEM + 10% SVF + 1% Pénicilline-Streptomycine (PS) + Insuline 50 µl + Epidermal Growth Factor (EGF) 250 µl. Ces conditions de culture ont été mises au point dans l’équipe avec l’expérience des méningiomes et des cultures méningées saines. La croissance cellulaire est vérifiée quotidiennement au microscope (Figure 3.4) et le passage cellulaire est réalisé à 80% de confluence (8 à 10 jours en moyenne). De nombreux essais de culture ont été nécessaires pour déterminer le temps de croissance moyen ainsi que les conditions idéales d’ensemencement au premier passage (P1) pour la réalisation des tests fonctionnels. Les numérations cellulaires ont été réalisées directement par comptage manuel au microscope, à l’aide d’une cellule de numération de Malassez. Le comptage était réalisé au P1 afin de réaliser FIGURE 3.3 : PRELEVEMENT DES MENINGES DE LA CONVEXITE ET DU FEUILLET ARACHNOÏDIEN DE LA BASE DU CRANE CHEZ UNE SOURIS ADULTE.
c b
88
un ensemencement optimal des cellules. Chaque comptage était effectué 2 fois par culot cellulaire et la concentration retenue était la moyenne des deux pour réduire les variabilités du comptage manuel.
2. INFECTION PAR LE VIRUS RCAS IN VITRO
Les cellules méningées de souris PGDS-tva hétérozygotes ou homozygotes sont mises en culture, en différenciant les cellules prélevées à la base de celles prélevées à la convexité. Lorsque l’on atteint 80% de confluence, le milieu de culture est retiré et remplacé par le surnageant de culture des cellules DF1, pendant 24h à 37°C. On répète cette étape tous les jours pendant 5 jours. On privilégie des DF1 ayant été cultivées le moins longtemps possible (au maximum 6 semaines) dans l’hypothèse où la transfection pourrait être compromise par la multiplicité des passages. Pour des utilisations ultérieures ce surnageant peutêtre congelé à -80°C. Étant donnée la solidité de cette méthode dans la littérature4,66, la difficulté à corréler dosage du virus et taux d’infection dans les cellules arachnoïdiennes, non décrites, et après discussion avec Frank Szulzewsky, chercheur de l’équipe d’Eric Holland, le virus n’a pas été dosé de façon reproductible.
a
b
FIGURE 3.4:CELLULES ARACHNOÏDIENNES EN CULTURE AVANT LE PREMIER PASSAGE.A-J4 LES CELLULES
COMMENCENT A ADHERER ET A SE MULTIPLIER A PROXIMITE DU TISSU DEPOSE (ETOILE)(FAIBLE GROSSISSEMENT) B-J7 LES CELLULES SE MULTIPLIENT AUTOUR DU TISSU JUSQU’A OCCUPER TOUTE LA SURFACE.
89
3. IDENTIFICATION ET TRI DES CELLULES MENINGEES PGDS POSITIVES
L’objectif de cette partie est d’évaluer, parmi les cellules en culture, la proportion de cellules PGDS positives et de pouvoir les trier afin de rendre plus spécifiques les manipulations in vitro
réalisées.
OBSERVATION DIRECTE
Des cellules infectées par le RCAS-GFP sont observées directement au microscope à fluorescence.
IMMUNOCYTOCHIMIE ANTI-PGDS
- Les cellules arachnoïdiennes non infectées sont cultivées sur des lamelles ou dans des boîtes Labtek (Sigma C7182) avec environ 2000 cellules/puits comme décrit précédemment puis fixées au PFA 4% dix minutes à température ambiante et rincées au PBS 1X.
- Les cellules sont perméabilisées dans du PBS1X-Triton 0,2% à température ambiante pendant 1h.
- Une étape de démasquage (tampon citrate 30 minutes à 95°C puis 30 minutes à température ambiante, suivi d’un rinçage à l’eau froide) a été réalisée sans amélioration des résultats donc abandonnée.
- Le blocage est réalisé par du PBS1X-Triton 0,4%-BSA 2% pendant une heure à température ambiante. Les puits sont incubés dans de l’anticorps primaire polyclonal anti-PGDS de chèvre (Santa Cruz SC18526) à différentes concentrations (1/100 à 1/2000) dans du PBS-1X-Triton 0,1%-BAS 3% pendant 1h à température ambiante, ou sur la nuit à 4°C, puis rincés en PBS.
- Des essais avec l’anticorps primaire monoclonal anti-PGDS de lapin (Santa Cruz sc390719) sont réalisés sans résultat satisfaisant.
- Incubation avec l’anticorps secondaire Alexa 488 anti-chèvre à 1/1000 d’âne (Life Technologies, A11055) ou l’anticorps secondaire Alexa 488 anti-lapin à 1/1000
90
(Invitrogen, A21206) selon les recommandations du fournisseur pendant 1h à température ambiante, puis rinçage en PBS.
- Les lames sont montées au Fluoromount (Thermo Fisher 00495952) et observées au microscope à fluorescence.
TRI DES CELLULES PGDS-POSITIVES PAR FACS
Les cellules en culture sont infectées avec le RCAS-GFP selon le protocole décrit précédemment, récupérées par trypsination 5 minutes à température ambiante lorsqu’elles arrivent à confluence et resuspendues dans du milieu de culture à une concentration de 1.000.000 cellules/ml. Elles sont ensuite triées par FACS (Fluorescent activated cell sorting, FacsARIA II SORP, logiciel FACSDiva version 6.1.3) sur la plateforme de l’université (CyPS) en fonction de leur fluorescence GFP, pour la selection des PGDS-positives. Les critères de sélection du tri sont choisis avec l’ingénieur de la plateforme de façon à exclure les débris et à séparer les populations de cellules distinctes.
Cette méthode de tri de cellules PGDS-positives évalue en même temps la proportion de cellules PGDS-positives et l’efficacité de la transfection RCAS, qui est supposée être élevée (ref RCAS holland). Les cellules triées GFP positives sont ensuite remises en culture comme décrit précédemment et la fluorescence GFP examinée au microscope à fluorescence. Ces cellules PGDS-positives peuvent ensuite être infectées à nouveau par RCAS16 ou RCAS17 pour d’autres études.
4. TESTS FONCTIONNELS
Des tests fonctionnels sont réalisés sur des cultures de cellules arachnoïdiennes après transfection par l’un des virus RCAS (RCAS-GFP, RCAS16 ou RCAS17) afin de comparer l’effet de la fusion in vitro.
91
A) APOPTOSE – TEST CASPASE OU ANNEXINE V
La méthode de détection de l’apoptose est une méthode de détection immuno-cytochimique de la caspase-3 clivée (=activée), les caspases étant des protéases initiatrices de l’apoptose.
- Après la culture cellulaire initiale, au premier passage, 4.000 cellules arachnoïdiennes/puits ont été déposées dans des chambres de culture LABTEK. - Après une incubation pendant 2 heures à 37°C, les cellules sont fixées par une solution
de 4% de paraformaldehyde (PFA).
- On procède ensuite à un immunomarquage selon le protocole du fournisseur à la concentration 1:200, anticorps de lapin Cleaved Caspase-3 Antibody (Cell Signaling, #9661) puis anticorps secondaire anti-lapin (Alexa 555, Cell Signaling 9126). Les lames sont montées au Fluoromount-G+DAPI (Thermo Fischer).
- Les lames ont ensuite été visualisées par microscopie à fluorescence avec un filtre spécifique de la fluorescéine permettant de visualiser les noyaux colorés en bleu (DAPI) et un filtre spécifique de la rhodamine permettant de visualiser les cellules contenant de la caspase-3 clivée en rouge orangé.
L’autre méthode de détection de l’apoptose est une méthode de détection en cytométrie en flux : en phase précoce de l’apoptose, il est possible d’observer la translocation de la phosphatidyl-sérine de la face interne à la face externe de la membrane cytoplasmique. Celle-ci est mise en évidence par fixation spéCelle-cifique de l'Annexine V couplée à un fluorophore et analysée par cytométrie en flux.
D’autres marqueurs de viabilité cellulaire comme l’iodure de propidium (PI), utilisés conjointement avec l’annexine V, permettent de différencier les cellules apoptotiques (simples positives à l'annexine V) des cellules nécrotiques (doubles positives à l'annexine V et au PI). Cette technique permet le comptage des cellules vivantes, apoptotiques et nécrotiques dans un échantillon. Nous avons effectué ces tests également dans le cadre du travail d’un autre étudiant de l’équipe, Julien Boetto22.
92
B) PROLIFERATION – TEST WST1 OU COMPTAGE MANUEL
Les cellules sont mises en culture dans des plaques 96 puits à la concentration de 3000 cellules/puits dans 100µl de milieu de culture et incubées 24h puis 10% de solution de WST1 (Sigma, 5015944001) est ajouté au milieu et les cellules sont incubées pendant 3h à 37°C. La coloration induite lors de la réaction, reflétant la prolifération, est ensuite détectée par spectroscopie, en mesurant la différence entre l’absorbance à 620nm et l’absorbance à 450nm. La prolifération peut être également évaluée par comptage des cellules sur cellule de Malassez après 1, 4 et 7 jours.