Génotypage des champignons filamenteux dans la mucoviscidose

Si l’isolement d’un champignon par mise en culture d’un prélèvement respiratoire signe la présence du microorganisme dans les voies respiratoires du patient, une question persiste sur la signification clinique de cette colonisation fongique. Dans ce contexte, seul l’isolement répété du microorganisme et la caractérisation génotypique des isolats successifs permet de différencier un portage transitoire de génotypes toujours différents et donc sans conséquence clinique d’une véritable colonisation chronique des voies respiratoires qui immanquablement participe à la réaction inflammatoire et à la dégradation progressive de la fonction pulmonaire. Le typage est donc nécessaire pour guider la décision thérapeutique.

Pour longtemps, le typage a consisté dans l’étude de caractères phénotypiques comme la morphologie des colonies associée à des tests biochimiques ou sérologiques ou encore à l’étude du profil de sensibilité aux antifongiques. Cependant, ces méthodes étaient peu reproductibles, et surtout d’un pouvoir discriminant limité (Gil-Lamaignere et al., 2003). Avec le développement des méthodes d’étude de l’ADN, de nouvelles techniques beaucoup plus reproductibles ont été proposées permettant l’étude de la variabilité infraspécifique.

4.3.1. Amplification aléatoire d’ADN polymorphique (RAPD)

La RAPD (pour random amplification of polymorphic DNA) est une technique d’empreinte génétique basée sur l’amplification aléatoire par PCR de fragments d’ADN en utilisant une amorce de séquence courte, d’une dizaine de paires de bases. La séquence des amorces utilisées en RAPD est établie de manière aléatoire et ces amorces ont des températures d’hybridation relativement faibles (entre 20 et 30°C). Ces caractéristiques permettent à l’amorce de s’hybrider en différentes positions dans le génome, permettant ainsi d’amplifier un nombre variable de fragments (Williams et al., 1990). Cependant, pour chaque espèce, il faut utiliser en parallèle plusieurs amorces séparément et les amplicons obtenus pour chaque amorce sont par la suite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose. Enfin, le génotype RAPD d’un isolat est obtenu en combinant les profils électrophorétiques obtenus avec chacune des amorces. Ainsi, dans le contexte d’une infection disséminée par

S. apiospermum suite à une double transplantation pulmonaire chez un patient atteint de mucoviscidose, la RAPD a permis de démontrer que cette infection était la conséquence de la colonisation des voies respiratoires du patient avant l’intervention chirurgicale devant la

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mise en évidence d’un génotype commun entre des isolats cliniques provenant des expectorations du patient collectées dans les mois précédant la transplantation et ceux obtenus durant l’infection disséminée post-transplantation (Figure 14) (Symoens et al., 2006).

La RAPD est facile à réaliser, rapide et ne demande qu’une faible quantité d’ADN. De plus, cette technique ne nécessite pas de connaissance préalable sur le génome de l’espèce étudiée. Bien qu'elle ait une reproductibilité inter-laboratoire limitée, cette méthode a été largement utilisée pour le typage de champignons d’intérêt médical (Harun et al., 2009).

Figure 14 : Profils RAPD des souches de S. apiospermum analysées

par Symoens et al. (Symoens et al., 2006) avec les amorces UBC 701 (A) et UBC 703 (B). Pistes 1-6 : isolats épidémiologiquement indépendants.

Pistes 7- 8 : isolats obtenus à partir des expectorations avant la transplantation. Pistes 9-11 : isolats obtenus à partir des expectorations après la transplantation. Pistes 12-13 : isolats obtenus à partir l’humeur vitrée après la transplantation. M : marqueur de taille 100 pb.

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4.3.2. Amplification de séquences répétitives palindromiques (rep-PCR)

La rep-PCR est une technique de typage semblable à la RAPD qui consiste en l’amplification des séquences répétitives non codantes dispersés dans le génome. Les produits d’amplification sont en suite séparés par électrophorèse et les profils électrophorétiques obtenus sont comparés pour étudier le polymorphisme entre les isolats.

Le système DiversiLab^® (bioMérieux) est un système commercial conçu pour standardiser et simplifier l'usage de la rep-PCR par une automatisation. Il permet à la fois : (i) la réalisation des PCR avec des amorces permettant d’amplifier les séquences comprises entre ces séquences répétitives ; (ii) le marquage des produis d’amplification par fluorescence ; (iii) la séparation des amplicons par électrophorèse capillaire et ; (iv) la comparaison des profils électrophorétiques et l’élaboration des dendrogrammes pour les isolats étudiés (Figure 15) (Healy et al., 2004).

La rep-PCR a été appliquée avec succès pour l'identification des espèces dans divers groupes de champignons, y compris les espèces des genres Aspergillus (Healy et al., 2004) et Fusarium (Healy et al., 2005), comme pour la différenciation infraspécifique dans le genre

Aspergillus (Healy et al., 2004).

Figure 15 : Schéma de la rep-PCR automatisée et du système DiversiLab^®

(Healy et al., 2004).

A : Hybridation des amorces spécifiques et amplification ; B : Electrophorèse capillaire et obtention des profils électrophorétiques ; C : un rapport DiversiLab^® représenté sous forme d’un dendrogramme.

4.3.3. Typage par séquençage multi-loci (MLST)

La MLST (pour multilocus sequence typing) est une technique de typage des microorganismes basée sur l’analyse des variations nucléotidiques des séquences partielles de cinq à dix gènes constitutifs. Pour chaque locus étudié, les différentes séquences obtenues représentent des allèles distincts. La combinaison des allèles identifiés pour les différents loci définit le profil allélique ou la séquence type (ST) de l’isolat étudié. La MLST présente donc une excellente reproductibilité inter-laboratoires si les mêmes amorces et les

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mêmes conditions d’amplification sont utilisées. D’autre part, les données obtenues par MLST sont habituellement analysées à l'aide d'applications Web permettant une standardisation dans l'attribution des numéros des allèles et des ST. Néanmoins, bien que le principe de la MLST soit très simple, il est indispensable d’avoir des séquences de haute qualité pour une identification correcte des allèles (Figure 16) (Klaassen, 2009).

Cette technique, initialement développée pour la caractérisation de bactéries (Maiden

et al., 1998), a ensuite été appliquée au typage de champignons filamenteux, tels qu’A. fumigatus (Bain et al., 2007), Fusarium oxysporum (O’Donnell et al., 2004) et les

Scedosporium ( Harun et al., 2009 ; Bernhardt et al., 2013).

Figure 16: Principe du typage par séquençage multi-loci (MLST) (Klaassen, 2009).

4.3.4. Analyse de marqueurs microsatellites

Les microsatellites sont des fragments d'ADN courts (jusqu'à 10 pb), répétés en tandem, abondamment rencontrés dans le génome de la plupart des champignons. Les microsatellites sont amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques de la région flanquante de la répétition. Les amorces utilisées peuvent être marquées par un fluorophore, ce qui permet par la suite de déterminer la taille relative du fragment par électrophorèse capillaire (Klaassen, 2009).

Chez les champignons, le génome peut contenir des centaines à des milliers de microsatellites qui diffèrent par le nombre d’unités de répétition ainsi que par la taille et la séquence de l'unité de répétition. Ceci explique le pouvoir discriminant très important de cette méthode (Klaassen, 2009).

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4.3.5. Polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP)

Décrite pour la première fois en 1995, l’AFLP (pour amplified fragment length polymorphism) comprend trois étapes : (i) la digestion de l'ADN par des enzymes de restriction et la ligation d’adaptateurs spécifiques aux extrémités des fragments de restriction obtenus ; (ii) l’amplification par PCR à l’aide d’amorces spécifiques des adaptateurs ; et (iii) l’analyse de l’ensemble des fragments amplifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Vos et al., 1995). Cette technique de génotypage est facile à réaliser et présente un pouvoir discriminant élevé, mais l’interprétation des résultats est délicate et la technique est relativement coûteuse (Harun et al., 2009).

4.3.6. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

La RFLP (pour restriction fragment length polymorphism) consiste en une digestion de l’ADN génomique par des endonucléases (enzymes de restriction), suivie de la séparation des fragments obtenus par électrophorèse sur gel d’agarose. Cette digestion génère des profils électrophorétiques basés sur le nombre et la longueur des fragments de restriction obtenus. Le polymorphisme des souches peut se produire à la suite de mutations ponctuelles dans la séquence du site de restriction, l’acquisition ou la perte de sites de restriction, ou encore une insertion et/ou une délétion dans la séquence entre des sites de restriction. Ces mutations génèrent des variations dans le nombre et/ou la taille des fragments et donc une variation dans les profils électrophorétiques (Gil-Lamaignere et al., 2003).

Les fragments de restriction générés par la RFLP peuvent également être transférés sur une membrane de nylon ce qui va permettre par la suite l’hybridation de ces fragments avec des sondes marquées spécifiques d’espèce. De cette manière, seul un nombre restreint des fragments de restriction sont sélectionnés pour la comparaison des profils (Gil-Lamaignere et al., 2003).

4.4. Les principaux champignons filamenteux colonisant les voies