Généralités sur les immunodosages des stéroïdes

Les immunodosages correspondent à l’ensemble des méthodes analytiques quantitatives mettant en jeu la réaction antigène-anticorps. La plupart d’entre eux utilisent un troisième élément, le marqueur (radioélément, enzyme, luminophore).

Les stéroïdes sont des petites molécules hormonales, présentes dans les fluides biologiques sous plusieurs formes :

libres

conjugués à des protéines

liés aux protéines avec différentes affinités (p. ex.. serum albumine (SA)) ou protéines plasmatiques de transport spécifiques

La quantification est effectuée par déplacement par l’analyte d’une quantité fixe d’un traceur, de structure identique ou très proche de l’analyte, marqué par un radioélément, une enzyme ou un luminophore.

I.3.1 Obtention d’anticorps

Le faible poids moléculaire des stéroïdes engendre un certain nombre de particularités propres aux immunodosages stéroïdiens.

Les molécules de faible poids moléculaire (MM < 1000 g.mol^-1) étrangères à un organisme ne sont pas reconnues par les lymphocytes B. De plus, beaucoup de stéroïdes font partie du soi. Il n’est donc pas possible, d’obtenir par immunisation directe des anticorps contre des petites molécules (haptènes) telles que les stéroïdes. Il faut donc, dans un premier temps, les coupler de manière covalente à des molécules immunogéniques de haut poids moléculaire comme des protéines (albumine bovine BSA, ovalbumine OVA, thyroglobuline TG, hémocyanine, polylysine, …) puis, dans un deuxième temps, immuniser un animal (rat, souris, lapin, mouton, chèvre, …) d’une autre espèce que celle à laquelle

22 Verboven, C.; Rabijns, A.; De Maeyer, M.; Van Baelen, H.; Bouillon, R.; De Ranter, C. Nat. Struct. Biol. 2002, 9, 131-136. Swamy, N.; Head, J. F.; Weitz, D.; Ray, R. Arch. Biochem. Biophys. 2002, 402, 14-23. Head, J. F.; Swamy, N.; Ray, R. Biochemistry 2002, 41, 9015-9020.

correspond la protéine employée. Ce procédé permet de produire des anticorps dirigés contre la protéine inconnue et contre l’haptène couplé dessus.

La spécificité des anticorps anti-stéroïdes est directement liée à la structure de l’immunogène injecté à l’animal et plus particulièrement à la position et la structure du chaînon de couplage introduit par synthèse sur le squelette du stéroïde.

Les immunisations de gros animaux (lapin, mouton, chèvre, …) permettent des prélèvements conséquents d’antisera qui fournissent généralement suffisamment d’anticorps polyclonaux pour les utilisations ultérieures. Ces anticorps sont issus de plusieurs clones de lymphocytes qui chacun sécrète un anticorps (monoclonal) dirigé contre un épitope de l’immunogène.

A l’inverse, chez le rat et la souris, les prélèvements sanguins et donc d’immunsera sont trop faibles pour une exploitation à grande échelle de leur anticorps polyclonaux. En revanche, il est possible d’immortaliser les lymphocytes B, sécréteurs d’anticorps, localisés dans leur rate en fusionnant les cellules spléniques avec un myélome. Chaque hybridome ainsi obtenu conserve la capacité de sécréter un anticorps monoclonal tout en se multipliant à l’infini.

I.3.2 Techniques de couplage

Pour qu’un haptène puisse être couplé de manière covalente à une macromolécule porteuse, il doit posséder un ou plusieurs groupements fonctionnels complémentaires de ceux présents sur cette structure. S’il n’en possède pas, il est nécessaire d’en rajouter par le biais de la synthèse organique.

Les macromolécules porteuses les plus utilisés sont des protéines comme l’albumine bovine, facile à obtenir, ou la thyroglobuline, très immunogénique. En pratique, le schéma général d’obtention d’un immunogène comporte donc deux étapes :

synthèse d’un dérivé de l’haptène,

fixation covalente de ce dérivé à la protéine porteuse à l’aide d’un agent de couplage.

Ce couplage s’effectue le plus souvent par formation d’une liaison peptidique entre un groupement carboxyle de l’haptène et une fonction amine de la protéine. Mais d’autres types de liaisons peuvent être utilisées.

Le procédé de formation d’un dérivé de l’haptène dépend de la structure chimique de ce dernier. Il est donc très variable.

I.3.2.1 Couplage au moyen de carbodiimides La réaction générale de couplage est la suivante :

O OH Hap

N C N R² R¹

C N R² O

HN O Hap

R¹

Prot H₂N +

O N H Hap Prot haptène

carbodiimide

protéine immunogénique

conjugué urée

O N H N H

R² R¹

+

Les carbodiimides solubles dans l’eau les plus utilisées sont le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDCI) et le metho-p-toluènesulfonate de 1-cyclohexyl-3-(2-morpholino-éthyl)carbodiimide (CMC). L’excès de réactif est éliminé par dialyse. Cette méthode est très employée pour coupler des petits peptides, des hormones, des médicaments, de l’AMP cyclique…

I.3.2.2 Couplage au moyen d’ester de N-hydroxysuccinimide

La fonction acide carboxylique de l’haptène est condensée avec le N-hydroxysuccinimide par l’intermédiaire de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) pour donner un ester activé plus stable que celui de la précédente technique de couplage :

il ne réagit pas sur les hydroxyles, il ne s’hydrolyse pas rapidement, il peut être purifié avant le couplage,

il réagit spécifiquement sur les amines primaires peu encombrées telles que les ε-amines de lysines.

I.3.2.3 Couplage au moyen de diisocyanate

Le plus commun, le toluène 2,4-diisocyanate, permet de lier deux fonctions amines de deux molécules différentes. Le schéma de la réaction est le suivant :

Hap NH₂ N

Il est possible de réaliser cette réaction en deux temps : l’haptène réagit avec un excès de diisocyanate, puis après élimination de l’excès de réactif, le mono-isocyanate formé est mélangé avec la protéine.

Cette méthode s’applique surtout au couplage des peptides.

I.3.2.4 Couplage au moyen d’anhydride mixte

Un anhydride mixte peut être obtenu par exemple entre un dérivé hémisuccinate d’haptène et un dérivé chlorocarbonate ou chloroformate. Cet anhydride, stable en milieu non aqueux et à basse température, réagit ensuite avec une fonction amine de la protéine. Le schéma de la réaction est le suivant :

O

Cette méthode sert à préparer des conjugués de l’albumine avec des vitamines, des médicaments, des hormones…

I.3.2.5 Couplage au moyen d’un sel de diazonium La réaction est schématisée ci-dessous :

Hap NH₂

Un sel de diazonium de l’haptène à fonction amine est réalisé par action du nitrite de sodium en milieu acide et à basse température. Ce sel est alors condensé sur les groupes phénoliques des tyrosines de la protéine.

I.3.2.6 Couplage au moyen du glutaraldéhyde

Le glutaraldéhyde est une molécule bifonctionnelle qui permet de coupler entre elles deux fonctions amine primaire. Le glutaraldéhyde est aussi très utilisé dans le couplage des enzymes aux protéines.

O O

Toutes ces méthodes permettent de résoudre la plupart des problèmes de couplage.

I.3.3 Immunodosages

Il existe de nombreuses méthodes d’immunodosages, qui peuvent être regroupées en deux catégories (Figure 12) :

Les méthodes dites « en défaut d’anticorps » ou méthode par compétition entre l’analyte et un traceur,

Les méthodes dites « en excès d’anticorps » dont fait partie la méthode sandwich qui utilise la complémentarité de fixation de deux anticorps sur une même molécule d’analyte.

Ac

Figure 12 : Schéma réactionnel d’une compétition et d’un sandwich

Pour les haptènes, trop petits pour l’utilisation de méthodes sandwich avec deux anticorps, la méthode usuelle est le dosage par compétition.

L’analyte à doser (S), l’analyte préalablement marqué (S* : traceur) ainsi que l’anticorps spécifique de cet analyte (Ac) sont mis en présence dans un tube. Si la concentration en anticorps est limitante, c'est-à-dire lorsqu’elle est inférieure à la concentration en analyte marqué, il se produit une compétition entre le stéroïde de l’échantillon et le stéroïde marqué vis-à-vis des sites de l’anticorps. Il se forme deux complexes : S-Ac et S*-Ac selon les réactions suivantes :

Ac l’analyte, c'est-à-dire constitué de radioéléments tels que le tritium ou le carbone(14). Dans le cas de traceurs iodé(125) ou enzymatiques, la modification de taille, de polarité et de structure induit des différences de constantes d’équilibre. Il faut alors adapter la structure du chaînon pour obtenir une reconnaissance aussi proche que possible de celle de l’analyte et éviter une reconnaissance trop faible ou trop forte du traceur.

La détection de la radioactivité γ de l’iode(125) par rapport à la radioactivité β du tritium permet, en plus du gain en sensibilité lié à l’activité spécifique élevée de l’iode(125), une plus grande facilité de détection et de préparation du traceur.

Si les concentrations en anticorps et en analyte marqué sont connues et maintenues constantes, toute augmentation de la concentration d’analyte à doser entraînera une augmentation de la concentration du complexe S-Ac, diminuant ainsi la proportion d’analyte marqué lié à l’anticorps (S*-Ac). Il est alors possible de déterminer grâce au signal délivré par le marqueur, soit la concentration d’analyte marqué libre, soit la concentration d’analyte marqué lié à l’anticorps. Ceci peut être réalisé si l’on dispose d’une méthode de séparation entre la fraction libre et la fraction d’analyte complexé sans modifier l’équilibre de la réaction.

En utilisant une gamme de concentrations connues d’analyte (concentrations standards), il est possible d’établir une courbe d’étalonnage dans laquelle le signal mesuré à partir du marqueur lié aux anticorps est inversement proportionnel à la concentration d’analyte à doser. (Graphique 1)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0,1 1 10 100 1000

concentration du substrat

B/B0

Graphique 1 : Exemple de courbe d’étalonnage et IC₅₀

Les méthodes de dosage direct par compétition nécessitent que plusieurs conditions soient réunies : Un nombre constant de sites anticorps pour avoir une bonne reproductibilité. Ainsi, la quantité d’anticorps introduite ou la qualité du « coating » de ces anticorps sur les tubes doit être constante,

Une constante d’affinité élevée pour permettre une limite de détection très basse,

Une spécificité élevée permettant des dosages directs à partir des fluides biologiques, sans extraction des échantillons ni séparation chromatographique. En effet, il est nécessaire que l’anticorps soit capable de discriminer l’analyte des autres métabolites ou molécules de structures proches. Les réactions croisées donnent un aperçu des interférences possibles.