3.1.2 20-CO-(5-iodohistamine) vitamine D 59

HO

H

H

OpTs

HO

22 22 22 22

3 3

31 32

TBAF THF 47%

53 54

pTs-Cl pyridine 0°C

93%

NaI acétone

56%

Figure 66 : Synthèse de la 22-iodo vitamine D 54

Un élément déterminant remet en question l’utilisation industrielle de ce traceur iodé : la réaction de Finkelstein se fait dans l’acétone anhydre et avec de l’iodure de sodium solide ou séché. Or il n’est pas concevable industriellement de sécher de l’iode radioactif malgré ce qui est décrit dans la littérature.¹⁰⁵ Ce traceur est par conséquent abandonné.

II.3.1.2 20-CO-(5-iodohistamine) vitamine D 59

La 22-[¹²⁵I]iodo vitamine D 54 ne pouvant être préparée à grande échelle, il faut envisager des traceurs radioactifs plus classiques, par exemple un dérivé histaminé, iodé par l’association d’iodure de sodium et de chloramine T, réactif très utilisé pour ce type de marquages.

103 Perez-Sestelo, J.; Mascarenas, J. L.; Castedo, L.; Mourino, A. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 275-278.

104 Mascarenas, J. L.; Mourino, A.; Castedo, L. J. Org. Chem. 1986, 51, 1269-1272. Castedo, L.; Mascarenas, J. L.; Mourino, A.;

Sarandeses, L. A. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 1203-1206. Scheddin, D.; Mayer, H.; Wittmann, S.; Schönecker, B.; Gliesing, S.;

Reichenbacher, M. Steroids 1996, 61, 598-608.

105 Ali, H.; Rousseau, J.; Lafreniere, J.; van Lier, J. E. Steroids 2000, 65, 74-84. Ali, H.; Rousseau, J.; Gantchev, T. G.; Lier, J. E. v. J.

Med. Chem. 1993, 36, 4255-4263. Labaree, D. C.; Hoyte, R. M.; Nazareth, L. V.; Weigel, N. L.; Hochberg, R. B. J. Med. Chem.

1999, 42, 2021-2034. Owoyale, J. A.; Szinai, S. S. Steroids 1981, 37, 133-142.

Préparation du dérivé à ioder

L’étape préliminaire est l’obtention du dérivé histaminé 58 du premier haptène, 20-COOH vitamine D 20. Pour cela deux voies sont possibles :

Le couplage de l’histamine à la forme protégée de la vitamine D (les adduits-SO₂13a ou b), puis la poursuite de la synthèse : déprotection du triène, isomérisation du triène et déprotection de l’alcool.

(Figure 67)

Figure 67 : Synthèse du dérivé histaminé 58 à partir des adduits-SO2

Le couplage direct de l’histamine au même haptène que celui utilisé pour le couplage à la BSA.

Les mêmes conditions sont utilisées, l’haptène activé sous forme d’ester de N-hydroxysuccinimide 21 est dissous dans le THF et l’histamine en solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1 M est ajoutée en excès. (Figure 68)

22 22 5' R = I : 5'-Iodohistamine

Figure 68 : Synthèse des dérivés histaminés 58 et 59 à partir de l’ester activé 21

La première voie permet de travailler sur des produits intrinsèquement basiques et donc d’éviter les problèmes d’isomérisations du trans-triène en iso-triène rencontrés au début des travaux de recherche.

Mais après les améliorations apportées à l’étape de déprotection du triène et à la photo-isomérisation, il est plus intéressant de garder un maximum d’étapes communes entre l’haptène et le traceur. Par la suite, les traceurs seront tous issus du couplage de l’histamine sur les haptènes.

Marquage à froid

Préalablement à un marquage radioactif à l’iode(125), les premiers dérivés à ioder ont fait l’objet d’un marquage « froid » dans les mêmes conditions qu’un marquage radioactif. Une solution de NaI 1 mM a d’abord été employée, avant d’utiliser, en conditions réelles, une solution à 50 µM. L’agent oxydant du NaI est la chloramine T et le milieu réactionnel est composé de méthanol et de tampon phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,4. En fin de réaction, un excès d’une solution de métabisulfite de sodium sert à réduire le I2 volatil et susceptible de rester malgré le fait qu’il est présent en défaut par rapport au dérivé à ioder. (Figure 69) En effet, les quantités d’iode(125) sont très faibles et il est préférable que celui-ci soit entièrement consommé pour limiter les pertes de radioactivité. De plus la diiodation du dérivé à ioder doit être évitée.

5' 5'

58

H

H

HO

N H

NH O N

H

H

HO

N H

NH N

I O

R

59 : R = H 60 : R = I 1. NaI aq.

Chloramine T

MeOH / Tp phosphate Ta 2. Na₂S₂O₅

Figure 69 : Marquage à froid de la 20-CO-histamine vitamine D 25

Le facteur primordial pour l’efficacité du marquage radioactif des dérivés à ioder de la vitamine D semble être la solubilité du dérivé à ioder dans le milieu réactionnel d’iodation. Ainsi, trop peu de méthanol engendre un faible rendement de marquage probablement à cause de la forte hydrophobicité du squelette de la vitamine D. Ce type de problème est aussi rencontré fréquemment lors des dosages et nécessite des précautions particulières qui seront discutées plus loin.¹⁰⁶

Le marquage à l’iode froid donne de bons résultats caractérisables en CLHP-UV à barrette de diode lorsque le substrat est pur et que l’iode est présent en quantité suffisante pour que le produit d’iodation soit visible en CLHP (voir Tableau 12 pour les conditions de séparation). Ce n’est pas le cas lors du marquage témoin froid avec 10 µg de dérivé à ioder et NaI 50 µM, pour lequel le pic d’iodation est perdu dans le bruit de fond du chromatogramme CLHP. Par contre, les essais d’iodation qui utilisent 0,5 équivalent d’iodure de sodium 1 mM pour 10 µg de dérivé à ioder 58 et un excès de chloramine T donnent un chromatogramme en accord avec ce que l’on peut attendre : trois pics, le premier est le substrat en excès (58 ; Tr 10 mn), le deuxième, de même dimension, est le produit de mono-iodation (59 ; Tr 15 mn) et le dernier, minoritaire, est le produit di-iodé (60 ; Tr 21 mn) (Figure 70).

106 Kobayashi, N.; Ueda, K.; Shimada, K. Clinica Chimica Acta 1992, 209, 83-88.

AU

Il reste alors à adapter la quantité de dérivé à ioder 58 pour que la solution de NaI la plus diluée et se rapprochant le plus des conditions réelles d’iodation puisse être utilisée. (Figure 71)

AU

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

AU

Figure 71 : Chromatogramme à 264 nm du marquage de 0,5 µ g de 20-CO-histamine vitamine D 58 (injection de 100 µ L)

Les essais préliminaires sont donc effectués sur 10 µg de dérivé à ioder 58 (DAI), puis les conditions opératoires sont par la suite adaptées à un marquage sur 0,5 µg de dérivé à ioder :

Les volumes sont conservés, ainsi la concentration des réactifs (chloramine T et métabisulfite de sodium) est divisée par 20. La vitesse de réaction diminue avec la concentration du dérivé à ioder dans le milieu réactionnel.

Le temps de réaction est passé à 2 mn.

L’iodure de sodium (≈10 µ L) est utilisé en quantité équivalente à celle de la solution radioactive (50 µM en solution aqueuse de NaOH pH 8) soit 1 mCi.

Il est très important que la chloramine T ne soit pas en trop fort excès par rapport au dérivé à ioder pour ne pas provoquer de réactions parasites.¹⁰⁷

Plusieurs facteurs ont été étudiés (Tableau 6) :

Des solutions de chloramine T de dates différentes (0 à 1 semaine) n’ont montré aucune différence d’iodation dans les chromatogrammes CLHP.

La présence d’un excès d’iodure de sodium par rapport au dérivé à ioder engendre une forte augmentation du pic du produit de diiodation, jusqu’alors négligeable.

L’utilisation de l’iodure de sodium en quantité équivalente au radioactif sur 10 µg de dérivé à ioder donne un pic de produit de mono-iodation de très faible intensité, à peine visible dans le bruit de fond dû aux impuretés , pourtant très minoritaires, du dérivé à ioder.

La diminution de la quantité de dérivé à ioder de 10 µg à 0,5 µ g et l’utilisation de l’iode froid rend le produit de mono-iodation visible sur le chromatogramme CLHP. Mais les réactifs utilisés sont trop dilués et ralentissent la vitesse de réaction.

L’utilisation de la même quantité de réactifs sur 0,5 µg que sur 10 µ g avec l’iode froid et toujours 2 mn de temps de réaction donne deux fois plus de produit de mono-iodation, sans dégradation visible. dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4

1 mg/mL dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4

5 mg/mL

Tableau 6 : Paramètres testés lors des marquages de la 20-CO-histamine vitamine D 58

Afin de faciliter le repérage et l’authentification du produit marqué, la 20-CO-(5-iodohistamine) vitamine D 59 a été synthétisée de manière indirecte par le couplage de l’ester activé 21 à la 5-iodohistamine 62 (Figure 68), préparée par iodation de l’histamine 61 pour ne pas utiliser le système iodure de sodium / chloramine T et pouvoir déceler ainsi d'éventuels artefacts.

La 5-iodohistamine 62 est préparée selon la méthode décrite par Tominga.¹⁰⁸ L’histamine est iodée en mélange biphasique hexane/solution aqueuse de soude 0,5 M par de l’iode en proportions stœchiométriques, qui après un traitement assez lourd, permet d’obtenir une fraction précipitée du

107 Farah, K.; Farouk, N. J. Labelled Compd. Radiopharm. 1998, 41, 255-260.

108 Tominaga, M.; Paiva, A. C. M. J. Med. Chem. 1969, 12, 693-694.

dichlorhydrate en mélange avec un peu de produit de diiodation 63 (Figure 72). Une purification plus poussée des eaux-mères permet d’obtenir suffisamment de dichlorhydrate de 5-iodohistamine pur pour effectuer des couplages avec les esters de N-hydroxysuccinimide des haptènes de la vitamine D.

61 H₂N

NH N

62 H₂N

NH N

I 63

H₂N

NH N