CHAPITRE II – SYNTHESE ORGANIQUE : PREPARATION DES HAPTENES,
II. 3.1.3 22-CMO-(5-iodohistamine) vitamine D 65
1. I2 / Hexane - NaOH 0,5M I
2. KIO3
+
Figure 72 : Iodation de l’histamine
II.3.1.3 22-CMO-(5-iodohistamine) vitamine D 65
Préparation du dérivé à ioder
De même que pour le traceur du 1er immunogène, les dérivés histaminé 64 et 5-iodohistaminé 65 ont été préparés par condensation des histamines correspondantes sur l’ester activé de la 22-CMO vitamine D 28. (Figure 73)
33 33 5'
5'
28
H
H
HO
N O O
O N O
O
NH N H2N
R
NH N N
H
H
H
HO
N O O
R
64 : R = H Rdt 36%
65 : R = I THF / NaHCO3 0,1M
R = H : Histamine R = I : 5'-Iodohistamine
Figure 73 : Synthèse des dérivés histaminés 64 et 65 à partir de l’ester activé 28
Une fraction de dérivé à ioder 64 est purifiée par CLHP analytique afin de garantir sa pureté pour des marquages à l’iode(125).
Marquage à froid
Le marquage de la 22-CMO-histamine vitamine D 64 est testé dans les mêmes conditions que pour le premier traceur (Figure 74). Les chromatogrammes CLHP ne montrent aucun produit d’iodation et le pic du dérivé à ioder (dérivé à ioder) est anormalement faible. L’explication provient du manque de solubilité du dérivé à ioder dans le milieu réactionnel lors du marquage.
Si les produits sont peu ou pas solubles au moment de la réaction ou avant l’injection dans en CLHP, ils précipitent ou s’adsorbent sur les parois du tube. En effet, il faut un mélange méthanol/eau plus riche en méthanol pour éluer le dérivé 22-CMO-histamine 64 en CLHP que pour le dérivé 20-CO-histamine 58 ce qui suggère la plus faible solubilité de la 22-CMO-histamine vitamine D 64 dans le milieu réactionnel.
5'
Figure 74 : Marquage à froid de la 22-CMO-histamine vitamine D 64
ESSAI 1 2 3 4 5 dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4
1 mg/mL
dilution avant injection 40 µL 40 µL
Métabisulfite de sodium dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4
5 mg/mL
Tableau 7 : Paramètres testés lors des marquages de la 22-CMO-histamine vitamine D 64
AU
Figure 75 : Chromatogramme à 264 nm du marquage de 10 µ g de 22-CMO-histamine vitamine D 64 (injection de 20 µ L)
Le paramètre le plus influent pour l’iodation du dérivé à ioder CMO 64 est donc la solubilité des dérivés de la vitamine D. Deux fois plus de méthanol lors de la réaction donne un chromatogramme CLHP correct. (Figure 75 ; Tableau 7)
La transposition à un marquage sur 0,5 µ g de dérivé à ioder n’a pas été testée, mais il ne fait aucun doute que les conditions du marquage du premier traceur, adaptées à la solubilité du CMO fonctionnent.
L’ensemble de ces considérations servira à la iodation des autres dérivé à ioder.
II.3.1.4 Préparation du dérivé à ioder 22-CO-histamine vitamine D 66
Le dérivé à ioder 22-CO-histamine vitamine D 66 a été préparé de la même manière que les précédents :
L’ester activé NHS 42 est mis en présence d’un excès d’histamine dans un mélange de THF et de bicarbonate de sodium 0,1 M aqueux. (Figure 76)
23 O N 23
O
H O
H
HO
O
42
H2N
NH N
N H N H
N
H
H
HO
O
THF / NaHCO3 0,1M
33% 66 : R = H Rdt 33%
67 : R = I R
Figure 76 : Préparation du dérivé à ioder 22-CO-histamine vitamine D 66
Une fraction de dérivé à ioder 66 est purifiée par CLHP analytique afin de garantir sa pureté pour les marquages à l’iode(125).
Marquage à froid
Le marquage est effectué sur une solution de dérivé à ioder 66 dans l’éthanol 96%, dont la concentration a été évaluée par dosage CLHP à 0,3 mg/mL. La quantité introduite correspond à environ 1 µg.
L’éthanol est évaporé et remplacé par le méthanol pour se placer dans des conditions proches de celles déjà utilisées pour les essais de marquage des précédents dérivés à ioder à l’INSERM et à Immunotech. Ces conditions d’iodation à froid fonctionnent normalement pour le dérivé à ioder 22-CO-histamine vitamine D 66.
II.3.1.5 Préparation du dérivé à ioder 23-CMO-histamine vitamine D 68
Le dérivé à ioder 23-CMO-histamine vitamine D 68 a été préparé de la même manière que les précédents :
ESSAI 1
22-CO-histamine vitamine D 66 1 µg Iodure de sodium "froid" 50 µM
0,5 éq.
Chloramine T dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4
1 mg/mL 20 éq.
Méthanol 23 µL Métabisulfite de sodium
dans tampon phosphate 0,1M pH 7,4
5 mg/mL 85 éq.
Temps de réaction 2 mn
L’ester activé de N-hydroxysuccinimide 44 est mis en présence d’un excès d’histamine dans un mélange de THF et de bicarbonate de sodium 0,1 M aqueux. (Figure 77) Le produit est obtenu quantitativement.
23 23
44
H
H
HO
N O O
O N
O
O
NH N H2N
H
H
HO
N O
H N
O NH
N
THF / NaHCO3 0,1M
100% 68 : R = H Rdt 100%
69 : R = I
R
Figure 77 : Préparation du dérivé à ioder 23-CMO-histamine vitamine D 68
Une fraction de dérivé à ioder 68 est purifiée par CLHP analytique afin de garantir sa pureté pour les marquages à l’iode(125).
II.3.1.6 Préparation du dérivé à ioder 22-(S-Bz-CO-histamine) vitamine D 70
Le dérivé à ioder 22-(S-Bz-CO-histamine) vitamine D 70 a été préparé de la même manière que les précédents :
L’ester activé NHS 46 est mis en présence d’un excès d’histamine dans un mélange de THF et de bicarbonate de sodium 0,1 M aqueux. (Figure 78)
22 22
46
H
H
S
HO
O O
N O
O
H2N
NH N
H
H
NH N
S
HO
N H O
THF / NaHCO3 0,1M
70 : R = H 71 : R = I
R
Figure 78 : Préparation du dérivé à ioder 22-(S-Bz-CO-histamine) vitamine D 70
Une fraction de dérivé à ioder 70 est purifiée par CLHP analytique afin de garantir sa pureté pour les marquages à l’iode(125).
II.3.2 Autres dérivés à ioder non-histaminés
Il est important de diversifier les traceurs (radioactifs ou autres) pour ne pas passer à côté d’un très bon anticorps qui ne peut se révéler qu’en présence d’un traceur associé de structure optimale permettant son exploitation dans un dosage. En pratique, dans un premier temps, chaque traceur histaminé
homologue des immunogènes est testé avec chaque anticorps. Il est possible par la suite de faire varier la structure du chaînon et la partie iodable.
II.3.2.1 Hydrogénation de l’acide urocanique
L’histamine peut être couplée sur les acides carboxyliques activés puis iodée sur son noyau imidazole.
Dans le cas de traceurs comportant un bras espaceur de type diamine, l’histamine ne peut plus être employée et il faut trouver un synthon de type acide carboxylique contenant un noyau imidazole. Une molécule possible ayant cette analogie de structure avec l’histamine est l’acide 3-(1H-imidazol-4-yl)-propionique 73 facilement obtenu par hydrogénation catalytique de la double liaison de l’acide urocanique 72 sur palladium sur charbon dans l’eau avec des rendements quantitatifs.109 (Figure 79)
72 NH
Figure 79 : Hydrogénation de l’acide urocanique 72
Par la suite, l’acide 3-(1H-imidazol-4-yl)-propionique 73 est activé sous forme d’ester de N-hydroxysuccinimide 74 par le carbonate de N,N’-disuccinimide dans le THF.