Gènes et voies dérégulés communs présents dans toutes les analyses

Afin d’avoir une représentation plus complète des voies perturbées, nous avons regroupé les listes de gènes dérégulés de chaque expérience pour chaque stade clinique. Pour le stade 1, 13274 sondes sont regroupées, soit 7262 gènes uniques reconnus par le logiciel IPA. Pour le stade 2, 14442 sondes sont regroupées, soit 7452 gènes uniques reconnus par le logiciel IPA. Pour le stade 3, 12534 sondes sont regroupées, soit 6802 gènes uniques reconnus par le logiciel IPA.

Ces 3 listes de gènes ont été soumises à IPA ce qui nous a permis d’identifier les 3070 gènes communs aux 3 stades correspondant aux gènes dérégulés dans les PBMC quel que soit le stade de la MP. L’analyse des voies canoniques par IPA à partir de ces 3070 gènes est présentée Tableau 31 en Annexe 11. De façon intéressante, s’y trouvent à nouveau la voie Ephrin/Rac/RhoA/cytosquelette d’actine/guidage axonal, des voies d’inflammation et d’activation leucocytaire (présentation d’antigènes, intégrines, extravasation leucocytaire), la régulation du cycle cellulaire (signalisation Cdc42, régulation G1/S, régulation des cyclines), les voies de mort cellulaire et d’apoptose, la signalisation p53, la signalisation PTEN, PI3K/AKT et

mTOR, la signalisation p38 MAPK et ERK5, l’ubiquitination des protéines, le dysfonctionnement mitochondrial et la signalisation neuregulin.

De la même façon, nous avons identifié les voies toxicologiques dérégulées dans les PBMC à tous les stades cliniques. Celles-ci comportent le dysfonctionnement mitochondrial, la signalisation p53 et les voies apoptotiques.

5.3 Discussion

Les analyses transcriptomiques des PBMC selon le stade de la MP ont mis en évidence une dérégulation des voies de signalisation RhoA/guidage axonal, de l’inflammation, du cycle cellulaire, de l’apoptose, des voies de survie et croissance cellulaire notamment MAPK dans les différents stades des analyses réalisées. Ces résultats semblent robustes puisque retrouvés chez différents sujets parkinsoniens à des stades différents de leur maladie et dans 3 expériences réalisées à partir de 2 plateformes de micro-puces différentes (Agilent et Illumina). A ce jour, peu d’études transcriptomiques se sont intéressées au profil d’expression selon le stade évolutif de la maladie. En effet, la majorité des études chez l’homme a porté sur l’étude de la substance noire ou d’autres aires cérébrales, uniquement accessibles post-mortem. En revanche, une équipe a analysé chez le macaque le profil d’expression génique cérébral (substance noire, cortex pré-frontal, globus pallidus et putamen) à différents temps d’une intoxication chronique au MPTP (Bassilana et al., 2005 ; Storvik et al., 2010). La symptomatologie parkinsonienne apparaît après 15 jours d’administration et 3 groupes d’animaux correspondant à 3 stades évolutifs différents ont été constitués (prélèvements cérébraux après 6 jours, 12 jours et 25 jours d’intoxication). L’analyse des listes de gènes dérégulés a été réalisée par le logiciel d’annotation DAVID qui est un autre outil bioinformatique d’analyse des données transcriptomiques (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) et a permis d’identifier les voies de signalisation KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Les résultats sont indiqués Tableau 21 et montrent un profil d’expression génique globalement similaire pour les animaux à un stade présymptomatique (J6 et J12) et un profil différent au stade avancé (J25). De façon intéressante, dans notre étude dans les PBMC pour le stade 1, nous observons comme chez le macaque MPTP au stade précoce, une dérégulation des voies de signalisation de différents cancers qui impliquent les voies de prolifération cellulaire et le cycle cellulaire avec notamment les gènes MAP2K1, MAP2K2 et CDC42. Par ailleurs, au stade plus tardif, est observé un dérèglement de la voie des MAPK dans le modèle animal, également retrouvée dans le stade 2 des PBMC humains. Enfin, à tous les stades, est notée une altération de la signalisation de l’inflammation indiquant qu’il s’agit bien d’un événement relié à la pathogénie de la maladie puisqu’identifié dans les analyses du

Tableau 21 : Voies métaboliques dérégulées dans différentes aires cérébrales chez le macaque intoxiqué par le MPTP à différents temps d’exposition (6 jours, 12 jours et 25 jours).

Nous n’avons pas indiqué les résultats issus de la substance noire car seule l’analyse à J25 a montré des voies KEGG dérégulées (maladie de Parkinson et infection à E Coli).

Cortex préfrontal Globus Pallidus Putamen

J6

Cancer pancréatique Infection E Coli Cancer vessie Maladies neurodégénératives Cancer pulmonaire Maladie de Parkinson

Gliome Maladie d'Alzheimer

Potentialisation à long terme Signalisation VEGF

Carcinome rénal Dépression à long terme Signalisation Fc epsilon Ri Adhésion focale Cancer colorectal Signalisation ErbB Mélanogénèse Signalisation GnRH Jonction GAP J12

Potentialisation à long terme Métabolisme glutathion Maladies neurodégénératives Mélanogénèse Métabolisme xénobiotiques cytochrome P450 Diabète de type I Signalisation GnRH Présentation antigènes Maladie à prion Dépression à long terme Molécules d'adhésion cellulaire Leucémie aigüe myéloïde

Jonction GAP Gliome Signalisation VEGF Carcinome rénal Cancer pancréatique Cancer vessie Cancer pulmonaire Formation axe dorso-ventral

Cancer thyroïde

J25

Signalisation MAPK Ribosome Potentialisation à long terme Maladie d'Alzheimer Jonction GAP

Molécules d'adhésion cellulaire Cytotoxicité médiée par cellules NK

Signalisation GnRH Diabète de type I

Dans l’analyse des 3070 gènes communs aux 3 stades qui correspondent aux gènes dérégulés quel que soit le stade de la MP, nous observons les voies canoniques et toxicologiques qui ont déjà été mises en évidence chez les sujets parkinsoniens de forme sporadique et porteurs de la mutation LRRK2. Une critique à notre analyse est que ces individus (sporadiques et LRRK2)

sont retrouvés en grand nombre dans les sujets inclus dans l’étude par stades évolutifs (44 parkinsoniens au total dont 18 sporadiques et 9 porteurs de mutation LRRK2). Néanmoins, les résultats sont concordants quand on rajoute d’autres types de MP (parkinsoniens de novo et avec mutation d’autres gènes EIF4G1, PRKN ou ATXN2) et semblent témoigner d’une dérégulation robuste de ces voies dans les PBMC de sujets atteints par la MP. Nous avons ainsi mis en évidence une dérégulation au sein des PBMC des voies Ephrin/Rac/RhoA/cytosquelette d’actine/guidage axonal, des voies de l’inflammation, de régulation du cycle cellulaire, de la mort cellulaire (apoptose, p53, mitochondrie), des voies de survie et croissance cellulaire PTEN/PI3K/AKT/mTOR et ERK/MAPK. Ces différentes voies ont récemment été associées à la MP (voir discussion générale en Vème partie du manuscrit).

Enfin, l’objectif principal de cette étude était d’identifier les voies moléculaires précocement dérégulées en utilisant des sujets parkinsoniens de novo sans traitement dopaminergique et des sujets porteurs de mutations délétères à un stade présymptomatique (Stade 1). L’analyse des 3 expériences de puces réalisée sur les 2 plateformes Agilent et Illumina nous a permis d’identifier 5 voies communes (Tableau 20). Ces voies semblent particulièrement intéressantes en raison de leur implication potentielle dans la pathogénie de la MP.

(1) La voie AMPK (AMP-activated protein kinase) constitue une voie majeure dans la régulation métabolique stimulant la production d’ATP en réponse à de nombreux stimuli. Elle contrôle le métabolisme glucidique et lipidique, la synthèse protéique et mitochondriale. Elle joue également un rôle dans le contrôle de l’autophagie et de la croissance cellulaire via la voie mTOR. Cette voie AMPK est activée lors d’une exposition au MPTP/MPP+ dans des modèles murins et cellulaires de MP et jouerait un rôle protecteur (Choi et al., 2010). De plus, l’expression de l’alpha-synucléine dans les cellules entériques est sous la dépendance de l’AMPc et de la voie ERK (Paillusson et al., 2010).

(2) La voie de signalisation du cancer pulmonaire à petites cellules implique des altérations des gènes MYC, PTEN, TP53 et RB. Ces différents gènes et leurs produits sont également impliqués dans la MP. En effet, l’expression de la Parkin est régulée par n-Myc (West et al., 2004) et une surexpression de Myc a été observée dans les astrocytes de la SN de sujets parkinsoniens (Ferrer & Blanco, 2000). La voie de signalisation PI3K/AKT est régulée par le gène suppresseur de tumeur PTEN qui est lui-même régulé par DJ-1 (Kim et al., 2005). p53 est une protéine clé dans le contrôle de la mort cellulaire et de l’apoptose dans la MP et son action est modulée par la Parkin (Alves Da Costa et al., 2011 ; Zhang et al., 2011). La phosphorylation de la protéine du rétinoblastome (pRb), protéine clé du cycle cellulaire, a été identifiée dans les neurones dopaminergiques de la SN de sujets parkinsoniens (Jordan-Sciutto et al., 2003) et la

(3) La protéine EIF2 (eukaryotic initiation factor 2) est impliquée dans la reconnaissance du site d’initiation de la traduction et l’adressage de l’ARNt de la méthionine au ribosome. De plus, LRRK2 est impliquée dans la répression traductionnelle via les micro-ARN et notamment s’associe à l’homologue de drosophile de EIF2C1 (Gehrke et al., 2010).

(4) RhoA est un membre de la superfamille des GTPases, qui joue un rôle central dans de nombreux processus biologiques comme l’organisation du cytosquelette d’actine, la dynamique des microtubules, la transcription, le cycle cellulaire et l’adhésion cellulaire. Cette voie de signalisation joue un rôle majeur dans la pathogénie de la MP et notamment est associée à LRRK2 (Chan et al., 2011).

(5) Enfin, la signalisation Wnt (Wingless/integration) participe à l’organisation du cytosquelette via RhoA, la transcription via la voie MAPK, l’ubiquitination des protéines et le cycle cellulaire via les β-caténines. De plus, les phosphoprotéines de la famille dishevelled (DVL) interagissent avec le domaine GTPase de LRRK2 et ce sont des protéines régulatrices de la voie Wnt nécessaires au guidage axonal, à la formation des synapses et au maintien des neurones (Sancho et al., 2009). Récemment la découverte de mutations au sein du gène VPS35 a également mis en avant cette voie de signalisation en raison de son inhibition en cas de mutations de VPS35, de la perturbation du recyclage des protéines membranaires et du trafic avec les endosomes (George et al., 2007 ; Vilariňo-Güell et al., 2011).

Au total, nous avons identifié pour ces stades cliniques des voies dérégulées qui sont le reflet au niveau des PBMC de la pathogénie de la MP. Certaines de ces voies sont dérégulées dès les stades précoces et pourraient être intéressantes à analyser plus en détail. Ces voies sont impliquées dans la survie, la croissance et la prolifération cellulaire. L’analyse des listes de gènes a permis d’isoler certains gènes (notamment AKT3 et SKP1) qui présentent une dérégulation quel que soit le stade de la maladie et pourraient ainsi être considérés comme des biomarqueurs potentiels à côté de l’expression de l’alpha-synucléine. A noter que SNCA n’est pas retrouvé dérégulé en raison de la présence dans le stade 1 du porteur de la duplication de SNCA qui présente une surexpression.

IV. TRAVAUX