Le gène ilsB :

Un deuxième gène (BC 0552), que nous avons nommé ilsB codant pour une protéine internaline-like de 864 aa (≈ 2500 pb) a été identifié dans le génome de B. cereus ATCC 14579. Ce gène présente une boite Fur dans sa région promotrice (5’-GATAATGA AAA TCATTATC-3’) identique à la séquence consensus. La protéine codée par le gène ilsB présente une similarité de 20 % avec IlsA. En plus de sa régulation par le fer, cette protéine présente des domaines LRRs responsables des interactions protéine-protéine et un motif C- terminal « LGATG » hydrophobe, suggérant la liaison de cette protéine à la surface de la bactérie (Figure 17). Ces observations suggèrent que l’expression du gène ilsB est régulée comme ilsA par le répresseur Fur. L’étude d’IlsB nous a paru intéressante, afin de savoir s’il existe une éventuelle interaction entre les deux internalines, d’une part, et afin d’obtenir des informations plus large sur le rôle des deux protéines de types internalines (IlsA et IlsB) chez B. cereus d’autre part.

1 Expression d’ilsB in vivo

Dans un premier temps, nous avons voulu savoir si ilsB s’exprime préférentiellement in vivo au cours de l’infection. Pour cela, nous avons cloné la région promotrice du gène pilsB en amont du gène qui code pour la recombinase site spécifique tnpI dans le plasmide pHT304- I du système IVET. Après transformation de la souche Bc::R2SK par le plasmide pHT304- pilsB, nous avons comparé la fréquence de résolution de la cassette RES in vivo (chez l’insecte après infection par voie orale) par rapport à sa résolution in vitro (en milieu LB). Les résultats que nous avons obtenus montrent que le gène ilsB est surexprimé in vivo (93%) au cours de l’infection par rapport à son expression in vitro (23%).

Ensuite nous avons suivi l’expression du gène ilsB en interaction avec le tissu de l’hôte, afin de savoir où ce gène est exprimé in vivo. La région promotrice pilsB a été clonée en fusion transcriptionelle avec le gène codant pour la gfp dans le vecteur pHT315. La cinétique d’expression a été suivie après infection par voir orale de G. mellonella avec B. cereus contenant la construction pHT315-pilsB’gfp. La figure 18 montre une très faible fluorescence des bactéries isolées à partir de l’hémocœle après 24 h d’infection, tandis que les bactéries isolées de l’intestin ne présentent pas de fluorescence. Ces résultats suggèrent qu’ilsB est exprimé dans l’hémocoele, mais à l’inverse d’ilsA son expression est beaucoup plus faible.

Figure 18 - Analyse de l’expression d’ilsB in vivo

Des observations microscopiques ont été faite sous lumière blanche et ultraviolet sur B. cereus contenant le plasmide pHT315-pilsB’gfp, isolées de l’intestin des larves vivantes et de l’hémocoele des larves mortes. Les bactéries vertes indiquent l’expression de la gfp due à l’expression du promoteur pilsB.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ctivi té spécif iques β- ga la ctosi d as e (Un ités M ill er ) Temps (Minutes) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 A ctivi té spécif iques β- ga la ctosi d as e (Un ités M ill er ) Temps (Minutes)

Figure 19 - Dosage de l’activité β-galactosidase de la fusion pilsB’Z dans la souche

B. cereus ATCC 14579

Les bactéries ont été cultivées en milieu LB (triangles verts) ou en milieu LB supplémenté avec le chélateur de fer, le dipyridyl (0.2mM). Le dipyridyl a été rajouté avant 30 minutes de la rentrée en phase stationnaire (Temps 0).

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2 Expression d’ilsB in vitro en absence de fer

Pour mesurer l’effet du fer sur l’expression d’ilsB, une fusion transcriptionelle a été faite entre le promoteur pilsB et le gène rapporteur lacZ dans le plasmide pHT304-18’Z. Le fragment d’ADN qui correspond à la région promotrice a été amplifié par PCR et inséré en amont de la séquence codante du gène lacZ pour donner le plasmide pHT-pilsB’Z. Ce plasmide a été introduit dans B. cereus par électroporation et l’activité β-galactosidase a été mesurée à différentes étapes de la croissance à 37˚C dans le milieu LB et en présence d’une concentration de 0.2 mM du chélateur de fer, le dipyridil. Une faible activité β-galactosidase (<100 unités Miller) a été observée en milieu LB alors qu’une très forte activité β- galactosidase (2000 unités Miller) a été observée en absence de fer (LB+dipyridil) (Figure 19). Toutefois, son niveau d’expression reste inférieur à celui d’ilsA (9000 unités Miller) et il s’exprime plus tardivement que le gène ilsA. Ces résultats confirment la régulation d’ilsB par Fur et les observations faites in vivo avec la fusion gfp.

3 Effet du gène ilsB sur la virulence chez G. mellonella

L’interruption a été faite en utilisant le plasmide intégratif et thermosensible pMAD avec la cassette de résistance à la Kanamycine. Des fragments de 900- 1000 pb du début et de la fin du gène ilsB ont été cloné de part et d’autre de la cassette kanamycine. Ensuite, ces trois fragments ont été insérés dans le vecteur thermosensible pMAD (vecteur couramment utilisé pour l’interruption de gènes chez les bactéries à Gram positif (Arnaud et al., 2004). L’inactivation d’ilsB a été faite par double recombinaison homologue pour créer la souche mutante B. cereus ∆ilsB. Après la construction du mutant B. cereus ∆ilsB, son rôle dans la virulence a été évalué après infection par voie orale de la larve G. mellonella. Les résultats que nous avons obtenus n’ont pas montré une diminution significative de la virulence de la souche mutante par rapport à la souche sauvage. Ces résultats montrent qu’IlsB n’intervient pas d’une façon significative dans la virulence, cependant un rôle durant le processus infectieux ne peut être exclu.

Nous avons également construit le double mutant B. cereus ∆ilsA∆ilsB, où les gènes des deux internalines IlsA et IlsB sont interrompus. Les tests de virulence ont été faits par voie orale et les résultats ont montrés que la virulence de la souche double mutante est moins affectée que le simple mutant B. cereus ∆ilsA. Ceci pourrait indiquer que d’autres gènes prennent le relais lorsque les deux gènes ilsA et ilsB sont absents.

Bc sauvage

Bc ∆ilsA Bc ∆ilsB Bc ∆ilsA∆ilsB

Bc sauvage

Bc ∆ilsA Bc ∆ilsB Bc ∆ilsA∆ilsB

Biofilm

A

B

Bc sauvage

Bc ∆ilsA Bc ∆ilsB Bc ∆ilsA∆ilsB

Bc sauvage

Bc ∆ilsA Bc ∆ilsB Bc ∆ilsA∆ilsB

Biofilm

A

B

Figure 20 - Capacité de formation de biofilm sur surface de verre de la souche sauvage B. cereus, des simples mutants B. cereus ∆ilsA et B. cereus ∆ilsB et du double mutant B. cereus ∆ilsA ∆ilsB

La souche sauvage et les différents mutants ont été incubé pour 36 heures en milieu HCT riche en fer (A) et en milieu HCT additionné avec le chélateur de fer, le dipyridyl (0.1 mM) (B).

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