Le gène, l’ARNm et la protéine

Le plasmide du clone positif a été extrait et la composition de l’insert a été définie par le service de séquençage du centre de recherche du CHUM. Le séquençage a révélé un ADNc de 1060-bp contenant une queue polyadénylée de 48-bp, confirmant ainsi qu’il s’agissait effectivement d’un gène exprimé. En utilisant le programme BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) fourni par le NCBI (National Center for Biotechnology Information), nous avons situé ce nouveau transcrit sur le chromosome 1 à la position 1p36.33 dans le contig NT_004350.18 près du gène de l’anp (1p36.21). Comme cet ADNc ne semblait appartenir à aucune famille de gènes connus et que cette région chromosomique ne contenait aucun gène déjà répertorié,

La technique du simple hybride chez la levure

Figure 2.1 Le criblage d’une banque d’ADNc de rein humain s’est effectué avec le système de simple hybride chez la levure en utilisant 3 copies sérielles du cGMP-RE comme appât. La protéine de fusion produite par l’ADNc se lie de façon plus ou moins intense au promoteur contenant le cGMP-RE et active la transcription du gène rapporteur. Figure tirée de Martel G., Hamet P., Tremblay J. (2010) J. Biol. Chem. 285, 20926-20939.

nous avons conclu à la découverte d’un nouveau gène que nous avons nommé grebp en relation avec sa fonction, soit la cGMP Response Element Binding Protein.

Nous avons réalisé un essai d’extension d’amorce afin de s’assurer de compléter la séquence nucléotidique de l’ADNc contenu dans le plasmide pACT2-GREBP qui était possiblement partielle dans la banque commerciale. Cette expérience a permis d’ajouter 23-bp à notre séquence originale (figure 2.2 A). Le contenu entier de la séquence du transcrit de GREBP a été confirmé par PCR en utilisant une seule amorce antisens et deux amorces sens, dont l’une est située en amont du site d’initiation de la transcription (-5/-25) et l’autre, ciblant précisément le site d’initiation (+1/+25). Aucun transcrit n’a été détecté dans la réaction -5/-25 utilisant de l’ARNm de cellules HEK293 rétro-transcrit, même si cette région a été amplifiée en utilisant de l’ADN de cellules HEK293 comme contrôle positif d’amplification (figure 2.2 B). La région +1/+25 a été efficacement amplifiée, aussi bien dans la réaction ayant comme cible l’ADN que dans celle contenant l’ADNc (figure 2.2 B). Ces résultats confirment que la taille totale de l’ARNm de GREBP, incluant la queue de poly(A) est de 1083-bp et que le gène est transcrit en un seul exon.

Détermination de la taille du transcrit de GREBP

Figure 2.2 A) La détermination de la taille totale de l’ARNm de GREBP a été réalisée par extension d’amorce. L’ARN total de cellules HEK293 a été rétro-transcrit en utilisant une amorce radioactive située dans une région connue de l’ARNm de GREBP puis analysé par électrophorèse parallèlement à une réaction de séquençage complétée à partir de la même amorce radioactive et du plasmide pACT2-GREBP. B) La taille totale du transcrit de GREBP a été confirmée par RT-PCR en utilisant des amorces sens ciblant l’amont (-25/-5) ou l’aval (+1/+20) du site potentiel d’initiation de la transcription et de l’ARN de cellules HEK293. De l’ADN de ces mêmes cellules a été utilisé comme contrôle positif d’amplification par PCR. Bien que l’amorce -25/-5 hybride et initialise l’amplification de l’ADN, elle y échoue avec de l’ADNc produit. Figures tirées de Martel G., Hamet P., Tremblay J. (2010) J. Biol. Chem. 285, 20926-20939.

A

L’analyse de la séquence de grebp nous indique que le gène possède un cadre de lecture de 348-bp codant pour une protéine de 115 acides aminés, d’une masse de 13.2 kiloDaltons (kDa) et d’un point isoélectrique de 11.3. La région non traduite 3’ (3’UTR) contient 2 éléments riche en AU (AREs) connus pour être impliqués dans la dégradation rapide des ARNm (figure 2.3, séquences soulignées) (285). La traduction virtuelle de GREBP et l’analyse de son contenu en acides aminés par les programmes d’ExPASy ont révélé une haute proportion de résidus basiques (23/115), caractéristique des protéines liant l’ADN (Figure 2.3, résidus encadrés). La séquence de la protéine contient également 6 sérines ayant des chances élevées d’être phosphorylées (probabilité: >0.800/1) et 1 thréonine pouvant être hautement phosphorylée (probabilité: >0.900/1) par les protéines kinases, incluant PKG (286), renforçant l’hypothèse que GREBP pourrait être impliqué dans une voie de signalisation du cGMP (Figure 2.3, résidus en gras). Les tableaux II et III présentent, de façons générales, les probabilités de phosphorylation des sérines et thréonines.

Les séquences nucléotidique et protéique de GREBP

Figure 2.3 Les motifs de déstabilisation de l’ARNm sont soulignés en double. Les résidus basiques encadrés, représentent 20 % (23/115) de GREBP et sont distribués tout au long de la protéine. Les résidus en gras sont ceux ayant davantage de chance d’être phosphorylés par une kinase sérine/thréonine, incluant PGK (sérine: >0800/1, thréonine: >0.900/1). Figure tirée de Martel G., Hamet P., Tremblay J. (2010) J. Biol. Chem. 285, 20926-20939.

Tableau II. Les probabilités de phosphorylation des résidus sérine ont été déterminées par les algorithmes développés par Blom et al. (286). Un pointage de 1 représente une phosphorylation assurée. Les résidus 26, 29, 32, 46, et 71 ont de très fortes chances (+++) d’être phosphorylés. La probabilité de phosphorylation du résidu 41 est forte (++) tandis que celle des sérines 48, 110 et 111 est faible (+). Les autres résidus ont peu de chance d’être phosphorylés (-).

Position (A.A) Séquence (A.A.)

9 QYYQSILII _0,002 - 20 HNGYSNKTR 0,005 - 26 KTRNSPLSL _0,970 +++ 29 NSPLSLLSP 0,974 +++ 32 LSLLSPRGY 0,983 +++ 41 PRHPSDIRP _0,830 ++ 47 IRPASSHMT 0,994 +++ 48 RPASSHMTK _0,526 + 54 MTKTSPHLN 0,177 - 64 IPNLSLTKR 0,014 - 71 KRKPSPHSL _0,996 +++ 74 PSPHSLNLI 0,165 - 81 LIHHSRQLR _0,002 - 97 TQNLSILLN 0,007 - 109 RMNNSSSTV _0,002 - 110 MNNSSSTVQ 0,474 + 111 NNSSSTVQP _0,561 +

Les prévisions de la phosphorylation des sérines de GREBP

Tableau III. Les probabilités de phosphorylation des résidus thréonine ont été déterminées par les algorithmes développés par Blom et al. (286). Un pointage de 1 représente une phosphorylation assurée. Seul le résidu 66 a une forte chance d’être phosphorylé. Les thréonines 51 et 53 ont des probabilités de phosphorylation moyenne (+/-). Les autres résidus ont peu de chance d’être phosphorylés (-).

Position (A.A.) Séquence (A.A.)

23 YSNKTRNSP 0,042 - 51 SSHMTKTSP _0,353 +/- 53 HMTKTSPHL 0,367 +/- 66 NLSLTKRKP _0,903 +++ 93 PNPATQNLS 0,038 - 112 NSSSTVQP- 0,046 - Probabilité de phosphorylation