Figure 9: Réalisation du frottis sanguin [43].
But du frottis : obtenir sur une lame de verre une couche unicellulaire d’éléments
figurés du sang répartis sur tout le frottis et fixés dans l’aspect le plus proche de leur état physiologique
Coloration au May-Grünwald Giemsa
Fixation
•Placer la lame du frottis sur un support horizontal au dessus d’un bac de coloration. •Verser sur la lame 15 gouttes de colorant May-Grünwaldpur de façon à recouvrir complètement le frottis.
•Laisser agir 3 minutes.
2- Coloration au May-Grünwald
•Ajouter autant de gouttes d’eau neutre que de gouttes de colorant, le mélange est rapide. •Laisser agir 2 minutes. (Préparer la dilution du Giemsa pendant ce temps.)
42 3- Coloration au Giemsa
•Préparer la dilution du Giemsa pendant les 3 minutes précédentes: pour cela introduire 20 cm3 d’eau neutre dans une éprouvette graduée, ajouter 30 gouttes de colorant de telle manière que celui-ci reste àla surface de l’eau neutre.
•Verser le contenu de l’éprouvette dans une boîte de Laveran. Dès que la lame est prête, mélanger en agitant doucement (le pouvoir colorant est maximum au moment du mélange). •Déposer la lame (frottis en dessous) dans la boîte, laisser agir 20 minutes (Giemsa lent). Rincer sous un jet d’eau neutre [43].
4- Séchage
•Laisser sécher la lame à l’air, en position inclinée, après avoir essuyé la face inférieure de la lame avec du papier filtre.
•Attendre au moins 5 minutes avant l’examen microscopique du frottis.
Un bon frottis est assez épais au début de l’étalement (1) pour s’amincir au milieu (2) et finir en forme de flamme avant la fin de la lame (3). La partie intermédiaire du frottis (2) est la plus appropriée pour l’examen microscopique.
Le frottis sanguin permet :
L’étude morphologique des éléments figurés du sang (forme, taille, couleur, inclusions….)
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2-4- Le myélogramme
Définition
Aspiration de la moelle osseuse au moyen d’un trocart (autre terme : cytoponction médullaire), le prélèvement permet une analyse quantitative et qualitative des cellules hématopoïétiques [49].
But :
-Diagnostic : anomalie de la NFS (origine centrale ou périphérique), exemple : myélodysplasies, leucémies aigues, myélomes, syndrome d’activation macrophagique…
-Suivi de maladie résiduelle
-Pronostic : analyses cytogénétiques -cultures bactério-,viro-,parasitologique -PCR parvovirus B19, HHV8 [49].
Principe de la technique du myélogramme :
Le myélogramme est un examen cytologique consistant à analyser de manière quantitative et qualitative les précurseurs hématopoïétiques médullaires. Les cellules souches et les progéniteurs, beaucoup plus rares et situés plus en amont de l’hématopoïèse, ne sont pas accessibles à cette étude morphologique.
Le myélogramme représente l’un des principaux outils de diagnostic de la plupart des hémopathies et permet la réalisation d’analyses complémentaires cytochimiques (coloration de Perls, myéloperoxydases, etc.) et immunocytochimiques [47].
Prélévement :
Le prélèvement du myélogramme est un geste médical consistant en une ponction-aspiration de suc médullaire. En résumé, les deux principaux sites de ponction médullaire chez l’adulte sont le manubrium sternal et l’épine iliaque postérieure. Le choix de la zone de ponction doit tenir compte des antécédents (irradiation sternale, sternotomie) et de l’état actuel du patient (intubation, etc.). Après éventuelle anesthésie locale préalable (patch de
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pommade du type Emla®) et désinfection cutanée obligatoire, la ponction se réalise à l’aide d’une aiguille à ponction lombaire, voire un trocart, auxquels est adaptée une seringue afin d’aspirer un peu de suc médullaire. Il est important de prélever un faible volume de suc médullaire (une à deux gouttes suffisent) afin de ne pas provoquer de dilution des cellules médullaires par des cellules sanguines. Les frottis médullaires doivent ensuite être réalisés très rapidement au lit du malade, sur des lames de verre à bords rodés et pans coupés, afin d’éviter la coagulation du suc médullaire (la seringue de prélèvement ne contient pas d’anticoagulant). La méthode de confection des frottis médullaires est similaire à celle des frottis sanguins [47].
Coloration de May-Grünwald-Giemsa :
Une fois secs, les frottis sont colorés selon la coloration de MayGrünwald-Giemsa (MGG) (en Europe, ou coloration de Wright aux États-Unis). Sauf exception, tous les frottis ne sont pas colorés d’emblée afin de constituer une réserve en cas de problème de coloration, casse de lames, colorations cytochimiques complémentaires ultérieures, congélation de lames…
En règle générale, deux à trois frottis sont choisis pour coloration parmi ceux qui semblent les plus riches (présence de « grains ») et les plus homogènes [47].
Lecture du myélogramme au microscope :
La lecture du myélogramme doit être effectuée par un cytologiste expérimenté et disposant d’un microscope de bonne qualité (100W) comportant au moins des objectifs × 10, × 50 (plan) et × 100 (plan). Un système de numérisation associé au microscope n’est pas indispensable, mais constitue un complément utile afin de conserver les images et les montrer pour confrontation. Outre l’identité du patient, le cytologiste doit avoir connaissance des données d’un hémogramme avec formule manuelle de moins de 2 jours, ainsi que des renseignements biologiques et cliniques ayant conduit à effectuer cette analyse. En effet, le cytologiste se doit de posséder tous les éléments nécessaires, car la lecture d’un myélogramme est un acte biologique médical à la fin duquel le cytologiste est souvent amené à proposer un diagnostic [47].
45 Lecture et interprétation :
- Estimation de la richesse médullaire
- Estimation de la quantité de chaque lignée (mégacaryocyte, érythroide et granuleuse) (en %).
- Estimation de la qualité de chaque lignée.
Figure 12: Mégacaryocyte normal (X63) [47].. Figure 11: Frottis médullaire normale
(X10) [47].
Figure 10: Frottis médullaire de richesse diminuée (X10) [47].
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Recherche d’anomalies cytologiques qualitatives :
L’examen au fort grossissement permet la détection d’anomalies cytologiques : présence de cellules anormales (blastes, cellules de lymphome, cellules plasmocytaires dystrophiques, tricholeucocytes….).
De plus, cet examen permet de déceler des anomalies cytologiques plus fines dans les cellules. Ces anomalies qualitatives sont très variées. Ainsi, dans la lignée granuleuse, celles-ci peuvent être par exemple la présence de corps d’Auer dans les myéloblastes, la dégranulation des précurseurs et polynucléaires, une hypersegmentation nucléaire, un gigantisme cellulaire.
Les anomalies de la lignée érythroblastique sont, par exemple, un asynchronisme de maturation nucléocytoplasmique, des ponts intercytoplasmiques ou internucléaires, des inclusions, des ponctuations basophiles, une binucléarité, des mégaloblastes, etc [48].
Numération des cellules médullaires :
Toutes les cellules nucléées doivent être comptabilisées, à l’exception des mégacaryocytes, des cellules non hématopoïétiques (cellules adipeuses, ostéoblastes, ostéoclastes, cellules métastatiques, dont il faut bien sûr toutefois signaler la présence). Les cellules éclatées (Fig. 13) ou en mitose (Fig. 14) ne sont pas identifiables et ne doivent pas non plus être comptées, mais signalées si elles sont présentes en nombre particulièrement élevé. Dans l’idéal, il est conseillé de compter au moins 500 cellules sur des champs consécutifs afin d’optimiser la représentativité du décompte. Dans les cas où la moelle est appauvrie, le décompte peut ne se faire que sur 200 éléments, si possible sur plusieurs lames différentes. Dans les cas difficiles ou lorsqu’une catégorie cellulaire est présente en proportion « limite » pour effectuer un diagnostic, il est important de compter sur beaucoup plus d’éléments, sur des régions et des frottis différents, ainsi que de confronter les décomptes de plusieurs cytologistes. Un décompte normal est le reflet d’une maturation harmonieuse, sans hiatus de maturation, avec distribution « pyramidale » dans chaque lignée : peu de cellules immatures et de plus en plus de cellules matures [49].
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Figure 13: Cellules éclatées (X63) [49]. Figure 14: Cellules en mitose (X100) [49].
Difficultés d’interprétation :
La lecture d’un myélogramme peut présenter de multiples difficultés de lecture.
Les principales sont la reconnaissance de cellules très dystrophiques ou de cellules que le cytologiste n’a jamais observées en raison de leur rareté. Une autre difficulté consiste à évaluer le caractère significatif ou non d’anomalies, comme les dystrophies dans les formes frustes de syndromes myélodysplasiques.
Les diagnostics d’hémopathies sont actuellement de plus en plus souvent posés et précisés à l’aide du résultat d’un ensemble d’examens complémentaires, dont le myélogramme est l’un des premiers éléments. Outre ces difficultés, le cytologiste est assez souvent confronté à des frottis médullaires peu riches, pour lesquels il doit évoquer un prélèvement hémodilué, une présomption de myélofibrose ou une moelle aplasique. Cette distinction est importante, car elle doit inciter à renouveler le myélogramme en cas d’hémodilution et à effectuer une biopsie ostéomédullaire dans les cas de suspicion de myélofibrose ou d’aplasie afin d’établir le diagnostic de certitude, qui est histologique. Enfin, il faut décrire une autre difficulté d’interprétation du myélogramme, qui réside dans les cas où les frottis comportent de très nombreuses cellules altérées, ce qui risque de sous-estimer une population pathologique [48].
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Moelle hypo- ou aplasique :
Dans ce cas aussi, la moelle est pauvre, ce qui peut évoquer au premier abord une hémodilution. Il est parfois assez difficile de faire la distinction entre hémodilution et richesse réellement diminuée. Cependant, dans le cas d’une moelle hypoplasique, les précurseurs hématopoïétiques sont présents et il n’y a pas d’excès notable de polynucléaires et lymphocytes. Sont observés également quelques mégacaryocytes et macrophages. Enfin, le contexte clinique permet d’évoquer une aplasie médullaire secondaire (toxicité médullaire médicamenteuse par exemple). Néanmoins, si le myélogramme émet l’hypothèse d’une aplasie médullaire, c’est l’examen histologique de la biopsie ostéomédullaire qui apporte le diagnostic de certitude [47].