Deuxième partie:
3 Développement d'une procédure d'extraction et de fractionnement d'un sédiment lacustre récent
3.6 Fractionnement des neutres par Flash Chro
fraction composée des hydrocarbures aromatiques, une troisième fraction comportant des composés de polarités intermédiaires tels que les éthers et certains esters et cétones. La quatrième fraction contient les composés polaires tels que les alcools et la cinquième et dernière fraction, des produits fortement polaires tels que des composés polyhydroxylés. Cette séparation peut être effectuée par chromatographie en phase liquide basse pression (Klink, 1994; Riffé, 1994) pouvant être suivie de chromatographie sur couche mince (Adam et al., 2000; Grice et al., 1996; Schaeffer et al., 1995) ou de chromatographie liquide haute performance (HPLC) (Hopfgartner, 1991). La procédure de fractionnement des neutres sur cartouche SPE Silice a également été appliquée par Blum (1999). Cette dernière réduit sensiblement la durée de la séparation comparée à la chromatographie liquide basse pression. Elle a en outre l'avantage de limiter les pertes occasionnées en chromatographie sur couche mince lors de l'étape d'extraction de la phase stationnaire. Toutefois cette procédure ne permet pas la séparation des hydrocarbures non aromatiques et aromatiques.
3.6.2 Partie expérimentale
Un mélange de cholesta-3,5-diène (20 mg), de phénanthrène (5 mg), de cholestérol hydrocinnamate (5 mg), de cholest-4-én-3-one (5 mg) et de 7-déhydrocholestérol (5 mg) dissous dans 2.5 ml de dichlorométhane:hexane 1:1 a été utilisé pour tester la procédure de (Blum, 1999) et, si possible l'adapter à la séparation des hydrocarbures aromatiques et non aromatiques. Les tentatives pour obtenir cette dernière séparation sur cartouche SPE Silice (Supelco, Si-1g) sont restées infructueuses. L'utilisation du décane à la place de l'hexane ou d'une seconde cartouche SPE Silice pour affiner la séparation n'empêche pas le chevauchement des fractions. Il en est de même si une cartouche avec une phase stationnaire inverse C18 (Supelco, C18-1g) est utilisée. La limitation de la SPE peut être notamment expliquée par la résolution insuffisante obtenue sur ce type de support compact. En effet la chromatographie en phase liquide, pratiquée sur des colonnes de ≥ 20 cm, permet d'obtenir des séparations beaucoup plus affinées. La séparation sur SPE a donc été écartée au profit de la chromatographie liquide basse pression.
Figure 2.10: Courant ionique total obtenu après triméthylsilylation de la fraction alcool #4 de la tranche 30-36 cm de la carotte sédimentaire obtenue par chromatographie liquide basse pression en utilisant une phase mobile pour la fraction #3 hexane:chloroforme 40:60 et pour la fraction #4 chlorofome:méthanol 90:10 (Conditions d'analyses GC-MS: Colonne: DB-5, J&W, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm; Programme de température: 80 °C (1 min.) jusqu'à 150 °C à 15 °C/min. puis 2.5 °C/min. jusqu'à 300 °C (20 min.)). Signification des abréviations: x: nombre de carbones de l'alcool linéaire primaire correspondant.
La procédure de Wünsche (1987) de chromatographie liquide basse pression a été adaptée à une colonne de 6 mm de diamètre contenant 3 g de silice. Afin d'obtenir une bonne séparation des fractions aromatiques et non aromatiques la quantité de dichlorométhane utilisée pour déposer l'échantillon en tête de colonne est déterminante et ne doit pas dépasser 200 µl. Pour faciliter le transfert de l’échantillon sur la colonne dans un volume minimum de solvant, il est également important que l'échantillon ne soit pas séché complètement mais conserve des traces de solvant. L'utilisation de standards (cholesta-3,5-diène, 2.5 mg; phénanthrène, 10 mg; linoléate de méthyle, 15 mg; 5α-androstan-3β-ol, 5 mg) transférés avec 2.5 ml d'hexane et 200 µl de dichlorométhane a permis de connaître les volumes de solutions nécessaires pour éluer chacune
dernière fraction des composés fortement polaires. Cette procédure a été testée avec un extrait neutre provenant d'un sédiment de surface du lac de Cadagno. L'analyse par GC-MS des fractions #1-5 et d'une sixième fraction éluée avec 30 ml de méthanol pur a montré que les fractions #5-6 contiennent une faible proportion de stérols (4 à 5% sur la base de quantitation du stigmastérol et du cholestérol respectivement). Le remplacement de l'éluant hexane:acétate d'éthyle 60:40 par du chloroforme:méthanol 90:10 fait disparaître ces pertes.
Figure 2.11: Courant ionique total obtenu après dérivatisation de la fraction alcool #4 de la tranche 30-36 cm de la carotte sédimentaire obtenue par chromatographie liquide basse pression en utilisant pour la fraction #3 et #4 des portions successives de 30 ml hexane:acétone:méthanol 93:5:2 (autres conditions GC-MS identiques à celles données pour la Figure 2.10.).
Le chloroforme a été choisi plutôt que le dichlorométhane car ce dernier provoque facilement des craquelures dans la phase stationnaire de la colonne. Toutefois la séparation s'avère moins bonne en raison de la présence des alcools linéaires en plus des stérols dans la fraction #4 comme le montre la Figure 2.10 (tranche 30-36 cm de la carotte sédimentaire). La contribution des alcools linéaires dans cette fraction peut être sensiblement réduite en utilisant deux portions successives d'un mélange ternaire hexane:acétone:méthanol 93:5:2 pour éluer les fractions #3 et #4. L’analyse par GC-MS montre qu’avec cette procédure les stérols sont encore récupérés dans la fraction #4 avec des rendements ≥ 95% en se basant sur les pics du cholestérol, du sitostérol et
du stigmastérol. Par contre les alcools linéaires ne sont présents qu'à l'état de traces (Figure 2.11).
3.6.3 Procédure adoptée
La procédure adoptée utilise donc 3 g de silice 240-400 mesh (Fluka). La silice est conservée dans une étuve à 120 °C (au moins durant 24 heures) et sortie juste avant usage. Une fois à température ambiante, elle est introduite dans une colonne de 20 cm de longueur et 6 mm de diamètre interne muni d'un bouchon de laine de verre recouvert de 1 cm de sable de quartz. Après avoir bien tassé la silice en tapotant la colonne à l'aide d'un tuyau en caoutchouc, du sable de quartz est rajouté en tête de colonne sur 1 cm d'épaisseur. La colonne, placée sous chapelle, est ensuite enveloppée de papier absorbant imbibé d'éther ou de dichlorométhane. Cette opération permet de refroidir la colonne et évite les risques de craquelure de la phase stationnaire dus à l'application de pression en tête de colonne. 20 ml d'hexane sont utilisés pour le conditionnement. Le débit est ajusté à une goutte par seconde en appliquant la pression en tête de colonne à l'aide d'une poirette aspirante. 2.5 ml d'hexane ainsi que 2 fois 100 µl de dichlorométhane sont utilisés pour déposer l'échantillon. De la laine de verre est ensuite placée sur l'échantillon à l'aide d'une fine baguette en verre. Cette dernière est rincée avec 2.5 ml d'hexane. 20 ml d'hexane sont utilisés pour l'élution de la fraction hydrocarbures non aromatiques. 20 ml d'hexane:toluene 6:4 sont employés pour éluer les hydrocarbures aromatiques. 30 ml hexane:acétone:méthanol 93:5:2 sont utilisés successivement pour éluer la fraction #3 de polarité intermédiaire et la fraction #4 des stérols. La fraction des composés plus polaires est récupérée à l'aide de 25 ml de chloroforme:méthanol 80:20.