Elimination du soufre élémentaire

3.5.1 Données bibliographiques

Le soufre élémentaire est souvent contenu dans les sédiments en quantités très supérieures par rapport aux biomarqueurs présents. S'il n'est pas éliminé de l'échantillon, il pourra gêner voire empêcher l'identification et la quantification des analytes apolaires ou de faible polarité. Les hydrocarbures stéroïdiens sont concernés par ce problème et rendent indispensable l'étape d'élimination préalable du soufre élémentaire avant analyse. Cette opération est réalisée en exposant l'extrait organique à du cuivre activé soit directement pendant l'extraction (Grice et al., 1996; Grice et al., 1998; Grossi et al., 1998; Innes et al., 1998) soit en éluant l'extrait à travers une colonne (Kenig et al., 1995b; Leif et Simoneit, 2000; Simoneit et al., 1996; Summons et al., 2002). Une alternative consiste à mettre en présence le sédiment avec de l'hydroxyde de tétrabutyl ammonium (Kodba et Marsel, 1999).

3.5.2 Partie expérimentale

La procédure décrite par Wünsche (1987) a été testée en utilisant une colonne courte (1.5 cm x 12 cm) remplie de 50 g de poudre de cuivre (Fluka; purum, purété > 99%) et pouvant être tirée sous vide. La colonne est activée avec 15 ml de HCl 6 N puis rincée avec 100 ml d'eau bidistillée. 30 ml d'acétone et 30 ml de dichlorométhane sont successivement ajoutés pour éliminer l'eau résiduelle. La colonne a été testée avec 200 ml d'une solution de soufre à 0.25 mg/ml passés à un débit de 1 à 2 gouttes par seconde. La colonne a ensuite été rincée avec 25 ml de dichlorométhane. L’analyse par GC-MS de l'éluat, évaporé sous pression réduite et redissous

(100 mg dilué dans 60 ml de chloroforme) qu'il fût possible d'éluer totalement celui-ci à travers la colonne. L'analyse par GC-MS de l'extrait obtenu a confirmé l’efficacité du procédé pour l’élimination du soufre.

(a)

(b)

.

Figure 2.7: Courant ionique total (a) et spectre de masse par impact électronique moyenné (scans 30-37) (b) obtenus par introduction directe de la poudre de cuivre après passage de l'extrait organique total et rinçage avec du dichlorométhane (Instrument VG7070E; Energie d'ionisation : 70 eV; chauffage de l'échantillon 5 °C/s; Masses balayées: 45-800 amu; Vitesse de balayage: 2 s/scan; Interscan: 1 s).

Afin de vérifier si des lipides stéroïdiens n'ont pas été retenus sur le cuivre, ce dernier a été examiné par spectrométrie de masse en impact électronique par introduction directe (Figure 2.7). Le spectre de masse par impact électronique à partir de la poudre de cuivre vierge (Figure 2.8) provenant directement du flacon commercial (Fluka, purum) a également été obtenu. L'intensité du courant ionique obtenu pour ce dernier spectre est de 4% par rapport au spectre de la Figure 2.7. La comparaison des spectres et des courants ioniques montre que les ions observés dans le spectre de masse de la Figure 2.7 proviennent des composés retenus sur le cuivre lors du passage de l'EOT. La distinction de pics caractéristiques est rendue difficile par la superposition d'une multitude de spectres. Toutefois la Figure 2.7 montre que le soufre élémentaire (S8, m/z 256,

192, 160, 128, 64) apparaît accompagné d'une large proportion de composés organiques restés adsorbés sur le cuivre. En effet les pics régulièrement espacés de 14 amu à partir de 55 amu semblent indiquer la présence de composés linéaires. L'ion intense à m/z 191 pourrait être révélateur de triterpénoïdes pentacycliques. Enfin, les pics à m/z 255 et 213, caractéristiques de la perte de la chaîne latérale puis du cycle D des stérols, peuvent suggérer la présence de composés stéroidiens.

(a)

(b)

Figure 2.8: Courant ionique total (a) et spectre de masse par impact électronique moyenné (scans 50-60) (b) obtenus par introduction directe de poudre de cuivre vierge (Fluka) (Instrument VG7070E; chauffage de l'échantillon 2 °C/s; autres conditions identiques à la Figure 2.7):

L'ensemble de ces observations laisse supposer qu'une proportion significative de composés organiques a été retenue sur le cuivre. Il n'est pas exclu qu'une partie de ces composés soient des biomarqueurs nécessitant d'être quantifiés dans le cadre de ce travail.

Afin d'éviter que des composés organiques ne soient retenus par le cuivre lors de l'élimination du soufre élémentaire, le dichlorométhane utilisé lors de la procédure a été remplacé par un

de ce spectre, peu élevé, est du même ordre que celui de la poudre de cuivre vierge (Figure 2.8). La présence de composés organiques est de plus considérablement réduite par rapport à un rinçage au dichlorométhane.

(a)

(b)

Figure 2.9: Courant ionique total (a) et spectre de masse par impact électronique moyenné (scans 29-33) (b) obtenus par introduction directe de poudre de cuivre après passage de l'extrait organique total et rinçage avec le mélange chloroforme:méthanol 80:20 (Instrument VG7070E; Energie d'ionisation : 70 eV; chauffage de l'échantillon 2 °C/s; Masses balayées: 45-990 amu; Vitesse de balayage: 3 s/scan; Interscan: 1 s):

Enfin les pics du spectre de la Figure 2.9, peu nombreux, ne correspondent pas à des ions caractéristiques des biomarqueurs stéroïdiens, à des hopanoïdes ou à des n-alcanes. Il s'avère donc nécessaire d'effectuer l'élimination du soufre élémentaire en présence d'un solvant polaire tel que le chloroforme:méthanol 80:20. Si cette opération est effectuée à l'aide de dichlorométhane (Leif et Simoneit, 2000) ou de chloroforme (Simoneit et al., 1996), elle pourrait conduire à des pertes significatives de biomarqueurs. De même, si du cuivre est ajouté à un solvant apolaire tel que le dichlorométhane pendant la phase d'extraction, comme reporté

dans certaines études (Bechtel et al., 1996; Mastalerz et al., 1999; Sachsenhofer et al., 1995), une partie des biomarqueurs pourrait être perdue par adsorption sur le métal.

Notons qu'avec un seul passage sur la colonne de cuivre, la présence d'une faible quantité de soufre dans les fractions hydrocarbures a été constatée lors de l’analyse par GC-MS de quelques échantillons de sédiment. Suite à cette observation, deux passages de l'extrait sur colonne de cuivre ont donc été réalisés systématiquement pour éliminer le soufre résiduel.

Une dernière modification a été apportée à la procédure d'élimination du soufre élémentaire de l'extrait organique. Lorsque 100 ml d'eau bidistillée sont utilisés pour rincer la colonne, la poudre de cuivre brunit au lieu de garder sa couleur orangée. La présence d'oxygène dissous dans l'eau utilisée est responsable de l'oxydation du métal et conduit à une diminution d'efficacité de la colonne pour fixer le soufre élémentaire. Pour éviter la réoxydation du cuivre activé, l'eau bidistillée est dégazée par barbotage avec de l'azote pendant une dizaine de minutes. Le brunissement du cuivre n'est alors plus observé.

3.5.3 Procédure adoptée

Une colonne courte (1.5 cm x 12 cm) pouvant être tirée sous vide est bouchée de laine de verre. Elle est ensuite remplie de 50 g de cuivre puis recouverte d'un second bouchon de laine de verre. La colonne est activée avec 15 ml de HCl 6N puis rincée avec 100 ml d'eau bidistillée dégazée à l'aide d'azote. 30 ml d'acétone et un même volume de dichlorométhane sont successivement ajoutés pour éliminer l'eau restante. L'extrait organique neutre, correspondant typiquement à 10 g de sédiment lyophilisé, est dissous dans un volume de 50 ml de chloroforme:méthanol 80:20. Ce mélange est passé à travers la colonne à un débit de 2 gouttes par seconde. 10 ml de chloroforme:méthanol 80:20 sont utilisés pour rincer la colonne. Un second passage de l'extrait est effectué à un débit de 4-5 gouttes par seconde. 35 ml de chloroforme:méthanol 80:20 sont utilisés pour rincer une dernière fois la colonne.