La formation de longs tubes cristallins du dérivé EP stable

La formation de plus grandes vésicules par le processus de fusion, ne suffit pas pour former des tubes cristallins. Différentes concentrations en décavanadate ont été testées. L’augmentation de

Résultats

la concentration en décavanadate à 15 mM pour 3 mg/ml de protéine, permet d’observer par microscopie électronique en coloration négative, la formation de plaques après incubation 24 h à 4°C (Figure 39). Le diamètre de ces plaques peut atteindre plusieurs microns. A plus fort grossissement (Figure 40), nous observons que les bords des plaques sont cristallins et que la partie centrale semble être plus riche en lipide qu’en ATPases. Et surtout, nous observons que de longs tubes cristallins poussent à partir de ces plaques au bout de 24 h (Figure 39). Ces plaques proviennent de la fusion de vésicules, dont la membrane est probablement endommagée par la formation de glace pendant la congélation [150]. Ainsi, les bicouches partiellement fragmentées se rassemblent au moment de la décongélation lente et de nouvelles vésicules se forment avec un diamètre différent. Cependant, la présence d’ATPase-Ca2+, qui possède un domaine extramembranaire volumineux, doit réduire l’efficacité de la fusion. Ces têtes cytoplasmiques protubérantes dirigées vers l’extérieur de la vésicule de SR, limitent le contact entre les bicouches lipidiques. La présence de décavanadate améliore la rapidité ainsi que l’efficacité de la fusion des vésicules de RS. Le contact indispensable entre deux vésicules est favorisé par l’agrégation et la ségrégation d’ATPases-Ca2+ induites par le décavanadate. Les vésicules cristallines fusionnées forment ainsi des plaques, dont les bords cristallins constituent un réservoir d’ATPases pontées de façon réversible par le décavanadate, pour la croissance de longs tubes.

Figure 39 -

Différents exemples de formation de plaques cristallines à partir de vésicules de RS

–

Les photographies ont été obtenues par microscopie électronique en coloration négative.

Résultats

b) La formation de longs tubes cristallins du dérivé EP stable.

Nous avons essayé d’obtenir de longs tubes cristallins du dérivé EP stable. Pour cela, nous avons d’abord phosphorylé la FITC-ATPase à 1mg/ml en présence d’AcP et de calcium, ce qui nous permet de contrôler sa formation en suivant les changements de fluorescence du FITC (cf. A.1.2). Le dérivé EP est obtenu après les additions de 5 mM EGTA et 12 M thapsigargine. Puis, nous avons concentré le dérivé EP par ultracentrifugation et resuspendu le culot à 30mg/ml. Afin de s’assurer de la stabilité du dérivé EP (cf. C.1), les concentrations en EGTA et en thapsigargine ont été gardées constantes. Nous avons fait subir à cette nouvelle préparation trois cycles de congélation/décongélation. Après une incubation à 4°C pendant une heure, la solution a été diluée à 3 mg/ml avec une solution de cristallisation qui contient une forte concentration en décavanadate (15 mM final), en gardant toujours les concentrations en EGTA et en thapsigargine constantes. Bien que les vésicules soient cristallines, aucun tube n’a été observé après une semaine d’incubation à 4°C.

Figure 40 -

Grossissement des bords des plaques

cristallines

–

Les ATPases-Ca2+ apparaissent sous forme de ronds blancs sur ces photographies, obtenues par microscopie électronique en coloration négative. Les cercles et les flèches indiquent les zones cristallines des plaques. La grosse flèche en pointillée indique la direction de pousse du tube. La barre correspond à 100 nm.

Résultats

En modifiant la concentration en EGTA de la solution de cristallisation de 5 mM à 0,5 mM, nous observons par microscopie électronique en coloration négative, la formation de plaques identiques à celles observées pour la forme E2H3VO4 après incubation 24h à 4°C. Et surtout, nous observons que de longs tubes cristallins poussent à partir de ces plaques (Figure 41). Le diamètre des tubes varie entre 60 et 115 nm et leur longueur peut atteindre une dizaine de micron.

Nous avons démontré que le dérivé EP était stable sur plusieurs jours en présence de décavanadate et 5 mM EGTA (Figure 33, carré vide). La figure 42 montre que le dérivé EP est aussi stable dans les conditions qui permettent d’obtenir de nombreux tubes cristallins (Figure 42, cercle vide).

Figure 41 -

Différents tubes cristallins de la FITC-ATPase sous la forme EP – Les

photographies ont été obtenus par microscopie électronique en coloration négative - La barre correspond à 200 nm.

Résultats

c) L’optimisation de la cristallogenèse du dérivé EP stable.

Dans le but d’optimiser la formation des tubes cristallins, nous avons fait varier plusieurs paramètres physico-chimiques tels que le pH, la température ainsi que les concentrations en KCl, magnésium, EGTA et décavanadate de la solution de cristallogenèse.

Comme il a été décrit précédemment pour la formation de cristaux de la forme E2H3VO4 [90], nous avons observé que la formation des cristaux du dérivé EP est peu sensible à une variation de pH comprise entre 6,9 et 7,5. Nous avons choisi de nous placer à pH 7,2 pour la suite des études des conditions physico-chimiques de cristallogenèse.

La formation des tubes du dérivé EP ne s'observe que pour une température d'incubation de 4°C. Cette dépendance à la température peut s’expliquer soit par une agitation thermique défavorable pour la cristallisation de la Ca-ATPase, soit par la dépolymérisation du décavanadate en populations En effet, il a été décrit que cette dernière prend plusieurs jours à 4°C, alors qu’elle est plus rapide à 25°C [115].

Martonosi et ses collaborateurs ont montré que la cristallogenèse de la forme E2H3VO4 ne nécessite pas la présence de KCl [90], ce que nous observons également pour le dérivé EP stable. Par contre, Buhle et ses collaborateurs considèrent que la concentration optimale en KCl pour obtenir

Figure 42 -

La stabilité du dérivé EP obtenu à partir de [³²P]AcP –

Conditions d'obtention des vésicules cristallines : losanges vides ou conditions d'obtention des tubes cristallins : cercles vides.

[

32

P]-EP,

n

m

o

l/mg

0

5

10

0 2 4 6 8

Temps, jours

Résultats

des tubes cristallins de la forme E2H3VO4, est comprise entre 25 et 250 mM [116]. Nous n’avons pas d’explication pour cette divergence des observations.

En 1983, Dux et Martonosi ont démontré que la présence de magnésium n'est pas indispensable mais favorise la cristallogenèse de la forme E2H3VO4 [90]. Dans nos conditions, la présence de magnésium est indispensable pour obtenir les tubes du dérivé EP stable. Nous n’observons que quelques vésicules cristallines en absence de magnésium et aucun tube n’est observé avec une forte concentration (> 15 mM). La concentration optimale en magnésium pour obtenir de longs tubes ordonnés du dérivé EP stable est de 5 mM.

Dux et Martonosi en 1983 ont montré qu’une variation de la concentration en EGTA (0,5 - 5 mM) n'affecte pas ou peu la formation de vésicules cristallines de la forme E2H3VO4 [90]. Aucune étude sur les effets de la concentration en EGTA n’a été réalisée sur la formation des tubes cristallins. Dans nos conditions, aucun tube du dérivé EP stable n’a été observé avec une concentration en EGTA supérieure à 2,5 mM. La concentration optimale en EGTA pour obtenir le nombre le plus important de tubes cristallins du dérivé EP stable est de 0,5 mM (0,5 à 5 mM testés).

Comme pour la forme E₂H₃VO₄, la formation de cristaux de type vésiculaire du dérivé EP stable est rapide et s'observe à faible concentration en décavanadate [115]. Néanmoins, la formation des tubes cristallins du dérivé EP stable comme du E2H3VO4 à partir des vésicules de SR, nécessite la présence d’une forte concentration en décavanadate (15 mM pour 3 mg/ml de protéine). Le rapport décavanadate / protéine semble être important pour la fusion des vésicules de SR en plaques ainsi que la formation de tube.

Dans le document Formation, cristallogenèse et détermination de la structure tridimensionnelle, d'un dérivé phosphorylé covalent stable, de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique. (Page 86-91)