Les fonctions de Chk1

a) Régulation des origines de réplication

Après stress réplicatif, Chk1 a pour rôle de signaler l’arrêt des fourches à l’ensemble du noyau. Pour cela, elle phosphoryle différents substrats (Blasius et al., 2011). Les cibles clés de Chk1 sont les phosphatases cdc25 (A, B, et C) (Sanchez et al., 1997 (Fig13)). Leur

Figure 13 : Chk1 et la réplication de l’ADN

Chk1 inhibe les origines de réplication en empêchant le chargement de cdc45 sur la chromatine. Après stress réplicatif, Chk1 prévient l’activation de cdk2, mais aussi inactive cdc7. Chk1 empêche l’interaction entre topBP1 et treslin, ce qui aboutit au non chargement du complex CMG au niveau des origines de réplication. Adapté de (González Besteiro et Gottifredi, 2015).

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phosphorylation par Chk1 provoque leur inactivation et leur dégradation par le protéasome. La phosphorylation de cdc25A par Chk1 entraîne son ubiquitination par SCFᵝᵀʳᶜᴾ (Skip1/Cullin/Fbox proteinᵝᵀʳᶜᴾ), une E3 ubiquitine ligase, et par la suite, sa dégradation (Mailand et al., 2006 ; Busino et al., 2003). La dégradation de cdc25A inhibe l’activité de la cycline cdk2, ce qui arrête le cycle cellulaire, et empêche l’activation des origines de réplication.

Comme expliqué dans la première partie de l’introduction, les origines de réplication ne sont pas toutes activées au même moment, il est d’ailleurs dit que des origines adjacentes ont tendance à s’initier en même temps, formant un « cluster » (un groupe). Ces clusters sont entourés par des origines dormantes, qui restent normalement inactives, mais peuvent être activées en cas de stress réplicatif, afin de compléter la réplication. Chez le Xénope, après stress réplicatif, Chk1 est requis pour inhiber les origines de réplication en dehors du cluster déjà activé. L’absence de Chk1 provoque une augmentation de la densité de fourches, mais la distance entre les origines ne diminuent pas significativement, ce qui veut dire qu’il n’y a pas de nouvelle activation d’origine à l’intérieur du cluster. La surexpression de Chk1, lors de la réplication non perturbée, provoque une inhibition des clusters d’origines de réplication. Le contrôle de l’activation des origines de requiert Chk1, néanmoins la régulation de Chk1 doit être extrêmement fine (Platel et al., 2015). La sous- expression de Chk1, sans stress réplicatif, entraîne lui aussi une augmentation aberrante de l’activation des origines de réplication, ce qui engendre du stress réplicatif, et des cassures doubles brins (Syljuåsen, Sørensen, et Hansen, 2005).

L’inactivation de cdk2 empêche l’activation des origines de réplication, car cdk2 est responsable du chargement de cdc45, facteur participant à la formation du pré-IC (Cf partie I.A.1) pour le rendre actif. Il a été montré qu’à faible dose d’UV ou de benzo[a]pyrène (BPDE), cdc45 n’est plus chargé sur la chromatine indépendamment de la dégradation de cdc25A ou de l’inactivation de cdk2, mais toujours dépendante de Chk1. La régulation de l’activation des origines de réplication par Chk1 pourrait passer par des voies alternatives, quand la quantité de Chk1 phosphorylée n’est pas suffisante pour induire la dégradation de cdc25A (Liu et al., 2006).

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Récemment, il a été montré que la reconnaissance de cdc45 et de GINs au niveau des MCM, dépendaient du chargement de TopBP1 et de sa protéine de liaison treslin. Chk1 phosphoryle treslin dans sa région C-terminale, ce qui inhibe le chargement de cdc45 au niveau des origines de réplication et donc limite l’activation des origines. La dérégulation de l’interaction treslin/Chk1 entraîne une augmentation des origines actives. Cette étude montre que Chk1 durant la phase S non perturbée peut réguler l’activation des origines de réplication, via son action sur Treslin (Guo et al., 2015).

b) Rôle dans la tolérance des lésions à l’ADN

La tolérance des dommages peut être médiée par la synthèse translésionnelle. Elle est effectuée par des ADN polymérases spécialisées dites translésionnelles. Certaines de ces polymérases appartiennent à la famille Y des ADN polymérases (pol Kappa, pol Eta, pol Iota, et Rev1) mais aussi l’ADN polymérase Zeta de la famille B est capable de réaliser la TLS, ce mécanisme sera évoqué plus tard dans ce chapitre.

La monoubiquitination de PCNA est une voie de recrutement des polymérases specialisées à la chromatine. La monubiquitination de PCNA dépend de l’activité E3 ligase de Rad18. Le recrutement à la chromatine de Rad18 et de pol Eta, après traitement cisplatine ou HU, est promu par ATR et Chk1. De plus, une étude a montré que l’absence de Chk1 entraînait un défaut d’ubiquitination de PCNA, après UV. En effet, Chk1 serait capable de stabiliser claspine indépendamment d’ATR, ce qui permet à claspine de recruter Rad18 à la chromatine, et permet la mono-ubiquitination de PCNA (Yang et al., 2008). Il a également été montré que Chk1 est requis pour la phosphorylation d’APC/Cᶜᵈʰ¹, qui aboutit au recrutement de Dbf4/cdc7, suivi du recrutement de Rad18 (Yamada, Watanabe, et Mistrik, 2013).

En 2012, une étude a montré que la déplétion de Chk1 dans les cellules affectait la relocalisation de pol Eta en foyer après irradiations aux UV. Ils ont, également, observé un ralentissement des fourches de réplication après UV en l’absence de Chk1, mais ce ralentissement était indépendant de l’activité kinase de Chk1et de claspine. Par contre, le mutant du domaine d’interaction à PCNA et le mutant qui ne peut pas être relargué dans le

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nucléoplasme agissent comme des dominants négatifs, ce qui suggère que le domaine d’interaction à PCNA, et le déchargement rapide de Chk1 de la chromatine sont nécessaires pour la relocalisation de pol Eta après un traitement génotoxique. Pol Eta a été montré comme étant requise pour agir au niveau des fourches bloquées pour la reprise de la réplication, ce qui prévient l’activation du checkpoint de phase S après traitement à faible dose d’UV. Cependant, en l’absence de pol Eta, après traitement à faibles d’UV, Chk1 devient essentielle pour la reprise de la réplication, grâce à des voies alternatives comme la recombinaison homologue (Despras et al., 2010).

c) Rôle en mitose et à la transition en G2/M

En réponse aux dommages de l’ADN, Chk1 est capable de phosphoryler la phosphatase cdc25c. Cette phosphorylation aboutit à l'inactivation de cdc2 (Cdk1), ce qui inhibe le passage en mitose (Sanchez et al., 1997 ; Furnari, Rhind, et Russell, 1997) . La phosphorylation de cdc25c par Chk1 se fait sur la sérine 216, ce qui crée une attache pour la protéine 14-3-3, protéine contrôlant le cycle cellulaire et le checkpoint en réponse aux dommages de l’ADN. Cette liaison entre cdc25c et 14-3-3 entraîne l’export nucléaire de cdc25c aboutissant à une inactivation de cdk1 (Kumagai et al., 1998 ; Kasahara et al., 2010) . D’autre part, Chk1 peut phosphoryler et activer Wee1, kinase responsable de la phosphorylation inhibitrice sur cdk1, et donc entrainer l’inhibition de la transition G2/M via l’inactivation de cdk1 (O’Connell et al., 1997) . En 2009, une étude a montré un rétro- contrôle de Chk1 par cdk1. En effet, à la transition G2/M, Chk1 est phosphorylé par cdk1 sur les sérines 30 et 280, permettant son export vers le cytoplasme, et la pleine activation de cdk1/cycline B (Enomoto et al., 2009) .

En plus de son rôle dans la transition G2/M, Chk1 joue un rôle dans l’activation du point de contrôle du fuseau mitotique (Spindle Checkpoint). Ce point de contrôle nécessite le recrutement des protéines Mad, dont BubR1, un inhibiteur de l’initiation de l’anaphase. BubR1 est localisé au niveau des kinétochores. Il a été observé que Chk1 se localise au niveau des kinétochores, et que Chk1 est requis pour augmenter l’activité d’AuroraB, responsable du recrutement de BubR1. En conséquence, les cellules déficientes en Chk1 ne peuvent pas activer le point de contrôle du fuseau mitotique, ce qui entraîne de l’instabilité chromosomique (Zachos et al., 2007) .

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d) Rôle dans la prévention des cassures doubles brins

Lorsque les fourches bloquées ne sont pas prises en charge, elles peuvent s’effondrer et mener à des cassures doubles brins de l’ADN. Chk1 prévient la formation de cassures doubles brins de l’ADN, en inhibant des nucléases dont Mus81 qui coupent l’ADN au niveau des fourches bloquées (Forment et al., 2011) Cependant si la formation de cassures ne peut pas être évitée, Chk1 promeut la réparation par recombinaison homologue.

En effet, Chk1 phosphoryle Rad51 et BRCA2, effecteurs de la voie, ce qui stimule le recrutement de Rad51 aux sites de dommages (Sørensen, Hansen, et Dziegielewski, 2005)