Etude de l’interaction de pol Kappa avec des partenaires clés du checkpoint de phase S

a) Identification de nouveaux partenaires de Pol Kappa dans les celllules humaines

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Afin de mieux comprendre le rôle de pol kappa dans le checkpoint de phase S, nous nous sommes attachés à mettre à jour des partenaires dans cette nouvelle fonction. Peu d’informations sont connues à ce jour. Des interactions avec le clamp 9-1-1 ont été démontrées chez S. pombe (Kai, et 2003) et chez le Xénope (Bétous, Pillaire, et al, 2013), mais jamais dans les cellules humaines.

Par des expériences d’immunoprécipitation, nous avons trouvé des partenaires de pol Kappa. La difficulté dans la recherche de partenaires de pol Kappa vient du fait qu’il n’y a pas d’anticorps anti-pol kappa assez performants pour immunoprécipiter la forme endogène, il nous fallait donc passer par une expression ectopique. Nous avons surexprimé pol Kappa dans des cellules 293T, traitées par HU et lysées pour préparer un extrait nucléaire avec lequel nous avons réalisé l’immunoprécipitation. Les résultats montrent que pol kappa est bien immunoprécipitée et que les protéines Rad 9 et Chk1 sont co- immunoprécipitées (Fig 5A). Ainsi nous montrons pour la première fois que Pol Kappa interagit avec Rad9 et Chk1 dans les cellules humaines.

Pour confirmer ces résultats, nous voulions nous affranchir de l’étape de surexpression et travailler avec les protéines endogènes. Nous nous sommes donc penchés sur la technique de « Proximity Ligation Assay » (PLA). Après incubation avec les anticorps primaires dirigés contre les partenaires potentiels, les anticorps secondaires couplés à des sondes d’ADN sont ajoutés sur les cellules fixées. Si les protéines sont suffisamment proches (maximum de détection 40nm), les sondes d’ADN seront liées, ce qui permettra une amplification avec des dNTPs marqués via RCA (Rolling Circle Amplification), et cette amplification sera détectée par microscopie à fluorescence (Fig 6).

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Nous avons réalisé des expériences de PLA avec des cellules MRC5-SV ensemencées sur lamelles de verres, traitées ou non par HU (Fig 5B). Le nombre de cellules présentant des foyers est quantifié (environ 150 noyaux/condition n=3). Le couple pol Kappa/ PCNA a été utilisé comme contrôle positif d’interaction car l’interaction entre pol Kappa et PCNA a déjà été démontrée (Guo et al., 2008). Nous observons une interaction entre Pol Kappa et PCNA par la méthode du PLA. Et cette interaction est stimulée par le traitement par l’hydroxyurée. Le PLA a donc été étendu à l’étude de l’interaction entre Pol Kappa et les partenaires nouvellement par immunoprécipitation. Les résultats du PLA confirment ceux de l’IP, mais en plus nous montrent que les interactions entre pol Kappa-Rad9 et pol Kappa-Chk1 sont stimulées par HU. En effet, le pourcentage de cellules présentant des foyers passe de 15% à 45% (Fig 5B). Nous avons réalisé les mêmes expériences de PLA avec une polymérase spécialisée de la famille Y, l’ADN polymérase Eta (pol Eta), pour évaluer si ces interactions sont spécifiques de pol Kappa. Nous avons analysé dans les mêmes conditions les couples pol Eta/PCNA, pol Eta/Rad9, et pol eta/Chk1 (Fig 7). Comme attendu, après stress réplicatif,

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pol Eta et PCNA interagissent, par contre Pol Eta n’interagit ni avec Rad9, ni avec Chk1, confirmant ainsi la spécifité d’interaction entre pol Kappa/Rad9 et pol Kappa/Chk1.

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En conclusion, la forme endogène de pol Kappa interagit avec les formes endogènes de PCNA, Chk1 et Rad9. Ces interactions sont stimulées après stress réplicatif.

b) Effet des mutants de pol Kappa sur l’interaction avec Rad9 et Chk1

Nous avons réalisé des expériences d’immunoprécipitation avec les mutants pol Kappa-Dead et pol-Kappa PIP. Nous avons suivi le même opératoire qu’avec la forme WT de pol Kappa. De manière intéressante, nous pouvons voir que pol Kappa Dead ne semble pas interagir avec Rad9 et Chk1 après stress réplicatif alors que la forme PIP mutée interagit avec Rad9 et Chk1 (Fig 8A). L’interaction avec Chk1 semble, d’ailleurs, être stimulée après stress réplicatif (Fig 8B). Ces interactions entre pol Kappa PIP –Rad9, et pol Kappa PIP-Chk1 semble suggérer l’existence d’un complexe pré-formé entre pol Kappa et ses partenaires. En effet, l’IP est réalisée sur des extraits nucléaires, incluant les protéines solubles et insolubles, et pol Kappa PIP est moins recrutée, on peut penser que les interactions prennent place préférentiellement dans le nucléoplasme. Il est à noter que cette hypothèse est confortée par l’analyse de l’IP du mutant Dead de pol Kappa. En condition non traité, il y a une interaction entre pol Kappa dead et Chk1, mais après traitement HU, l’interaction est fortement diminuée. L’interaction entre Chk1 et pol Kappa semble être plus forte, quand pol Kappa est dans le nucléoplasme. Pour confirmer cette hypothèse, il faudra réaliser des immunoprécipitations sur la fraction nucléaire soluble et la fraction nucléaire insoluble.

En conclusion, il existerait un complexe libre 9-1-1-pol Kappa-Chk1 formé dans le nucléoplasme, ce qui confirme le résultat obtenu avec Hus1 (Fig 4A)

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C.

Conclusion sur le rôle pol Kappa dans le checkpoint de phase S

La connaissance du checkpoint de phase S n’impliquait pas de polymérase spécialisée au niveau de cette étape cruciale dans la réponse aux fourches bloquées or nos travaux démontrent l’implication d’une polymérase spécialisée, Pol Kappa.

Après induction d’un stress réplicatif par l’hydroxyurée, les polymérases réplicatives sont bloquées tandis que les hélicases continuent de dérouler l’ADN laissant l’ADN sous forme simple brin recouvert par la protéine RPA. Ce qui permet le recrutement des protéines appartenant à la voie ATR/Chk1.

L’ensemble des résultats montre un rôle important de pol Kappa au niveau du checkpoint de phase S. L’absence de pol Kappa entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1, qui se traduit par un défaut d’activation du checkpoint de phase S. Par des expériences d’immunodéplétion dans les extraits d’œufs de Xénope, il a été montré que pol Kappa était requis pour la synthèse de brins d’ADN naissants au niveau des fourches bloquées, ce qui permet une signalisation correcte du checkpoint de phase S. De plus, l’expression de la forme Dead de pol Kappa conduit à un défaut de phosphorylation de Chk1. Ces expériences démontrent l’importance du domaine catalytique de pol Kappa dans cette nouvelle fonction.

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L’expression du mutant dead provoque une relocalisation de pol Kappa en foyers de façon spontanée et son accumulation sur la chromatine en l’absence de stress. De façon intéressante, il a été montré par des expériences de FRAP (Fluorescent Recovery after Photobleaching), que la forme inactive de pol Eta avait un temps de résidence plus long en foyer (Sabbioneda et al., 2008) . Les structures de pol Eta et pol Kappa étant similaires, la formation de foyers spontanés de pol Kappa Dead pourrait s’expliquer de la même manière. Il serait intéressant de faire des expériences de FRAP afin de confirmer cette hypothèse. De plus, pol Kappa Dead semble interagir avec Chk1, cependant cette interaction est diminuée après HU. Il serait intéressant de réaliser des PLA avec le mutant afin de confirmer ce résultat.

Les nouvelles expériences réalisées par la suite approfondissent le mécanisme de recrutement. Les études sur les mutants nous montrent l’importance du domaine PIP pour le recrutement au niveau des fourches bloquées, et sur le recrutement à la chromatine du clamp 9-1-1. Nous avons vu que pol Kappa PIP et Rad9 interagissent. Bien que le domaine PIP ne semble pas requis pour cette interaction, il est important pour le recrutement à la chromatine du complexe pol Kappa/9-1-1. Nous montrons aussi une interaction entre pol Kappa PIP et Chk1. On peut donc imaginer, qu’après stress réplicatif, un complexe se forme entre pol Kappa /chk1/9-1-1, et que ce complexe est recruté à la chromatine via le PIP domaine de pol Kappa.

Récemment, un nouveau domaine PIP (PIP1) a été mis à jour dans pol Kappa. La mutation de ce domaine abolit l’interaction avec PCNA, contrairement à la mutation du domaine PIP2. Nous venons de réaliser des mutants de ce domaine, mais aussi des doubles mutants (PIP1+PIP2). A ce jour, nous n’avons pas encore de résultats avec ces mutants. Il sera intéressant d’étudier si les domaines PIP sont redondants et si la mutation des deux domaines amplifie le phénotype observé avec les mutant PIP2.

Nous sommes actuellement en train de réaliser des doubles mutants UBZ. En effet, les simples mutants UBZ ne montrent pas de phénotype fort. On voit une légère diminution des cellules présentant des foyers après stress réplicatif. La mutation d’un domaine UBZ pourrait être compensée par le domaine encore fonctionnel. L’étude du double mutant est intéressante, car les domaines UBZ ont été montrés comme étant requis pour la translésion.

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Nous allons regarder si la mutation des deux domaines affecte le recrutement de pol Kappa à la chromatine, dans un contexte de fourches bloquées, mais aussi, par des expériences d’IP et PLA, nous allons étudier ses partenaires.

L’ensemble de ces études nous permettrait d’approfondir le rôle de pol Kappa dans le checkpoint de phase S, mais aussi d’établir un modèle de recrutement au niveau des fourches bloquées.

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