Fluorescence du C12NBD-PC dans des membranes lipidiques homogènes sans

Il est attendu que dans une bicouche lipidique homogène LUV, la concentration

molaire membranaire moyenne en C12NBD-PC, CM, doit être égale à la concentration

molaire membranaire locale, CL, de la sonde dans n’importe quelle région de la membrane.

II.3.1 Effet de l’environnement sur la fluorescence dans des membranes

homogènes

L’effet de l’environnement lipidique sur l’intensité de fluorescence du C12NBD-PC inclu dans des bicouches lipidiques homogènes de composition variable a été examiné en tout premier lieu. La figure II-10 montre la dépendance à la température pour des valeurs comprises entre 4 et 70°C de la fluorescence spécifique (indiquée en intensité par µM de C12NBD-PC) de LUVs marquées avec 4 mol% C12NBD-PC, pour différentes compositions lipidiques et états de phase. Aux températures indiquées, les LUVs PC présentent une phase liquide désordonnée (ld). Les LUVs PC/SM 2:1 mol/mol présentent également une phase ld. Cependant on ne peut pas exclure la possibilité de l’apparition d’une phase Lβ aux basses températures (de Almeida et al., 2003). La courbe de fluorescence des LUVs SM pures

LUV de composition PC/SM +C12NBD-PC LUV de composition PC/SM/Chol +C12NBD-PC ld _ld lo C_L=C_M C_L>C_M C~ 0

montre un « décrochage » entre 35 et 40°C qui signe la transition entre la phase gel et la phase liquide désordonnée puisqu’il est connu que la transition de phase Lβ à ld de la SM d’œuf est détectée nettement autour de 38°C (Calhoun and Shipley, 1979). Enfin les LUVs SM/Chol 1:1 mol/mol montrent seulement une phase liquide ordonnée sur toute la gamme de température étudiée (de Almeida et al., 2003). Seules les courbes résultant des mesures ascendantes de température sont présentées, les courbes de température descendante pouvant se superposer sur celles-ci (voir la figure II-15).

L’intensité de fluorescence du NBD dans les LUVs de PC est très semblable à celle des LUVs de PC/SM 2:1 pour toutes les températures étudiées. La différence de composition lipidique des LUVs ainsi que la présence éventuelle d’une coexistence de phases Lβ-ld dans les LUVs PC/SM aux basses températures, n’ont donc pas d’effet significatif sur l’intensité de fluorescence dans ces deux membranes. Les fluorescences observées pour les LUVs SM pures et SM/Chol 1:1 mol/mol sont très basses, ce sont respectivement des membranes en phase gel (jusqu’à 40°C environ) et en phase lo (pour toutes les températures). Lorsque les LUVs SM

adoptent une phase ld aux températures supérieures à 38°C, le comportement de la

fluorescence rejoint celui des LUVs PC et PC/SM en phase ld. On observe donc que

l’intensité de fluorescence spécifique du NBD est plus élevée dans les phases ld que dans les phases gel ou lo. Une explication possible de ce phénomène serait que la partie NBD, située à l’extrémité de la chaîne hydrocarbonée coudée de PC, est expulsée plus efficacement de la région hydrophobe de la bicouche quand celle-ci est hautement structurée (comme c’est le cas dans les phases gel et lo), exposant ainsi le NBD plus près de l’interface avec l’eau. Rappelons que le rendement quantique de fluorescence du fluorophore NBD est proche de zéro dans l’eau et augmente lorsque la polarité de l’environnement diminue (Lin and Struve, 1991).

Un autre phénomène qui apparaît est le suiv ant, lorsque la température augmente, la bicouche devient plus désordonnée, ce qui a pour conséquence une diminution monotone de l’intensité de fluorescence (Mesquita et al., 2000), liée probablement à une pénétration plus grande des molécules d’eau à l’intérieur de la bicouche lipidique désordonnée. Ceci a pour effet d’augmenter la polarité de l’environnement du NBD et par conséquence de diminuer l’intensité de fluorescence du NBD. Enfin nous pouvons remarquer que l’augmentation de température au niveau des bicouches dans un état physique ordonné (état gel pour LUVs SM en dessous de la TM, ou état lo pour LUVs SM/Chol 1:1 mol/mol pour les températures comprises entre 4° et 70°C) n’a pas d’influence sur la fluorescence suggérant que les phases

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 10 20 30 40 50 60 70 T [ °C ] I ^{[ a} . u . / µ M ] PC SM PC/SM 2:1 SM/Chol 1:1

Figure II-10. Intensité de fluorescence spécifique du C12NBD-PC en fonction de la

température (intensité I en a.u par µM de C12NBD-PC) dans des LUVs contenant 4 mol% C12NBD-PC, pour différentes compositions et états de phase : LUVs PC ; LUVs PC/SM 2:1 mol/mol; LUVs SM ; LUVs SM/Chol 1:1 mol/mol. Les courbes résultent de mesures ascendantes de température, aucune hystérésis significative n’a été observée dans les courbes correspondantes descendantes.

II.3.2 Extinction de fluorescence du C12NBD-PC dépendante de la

concentration dans des membranes homogènes

La fluorescence spécifique du C12NBD-PC dans des LUVs PC/SM 2:1 mol/mol a été

mesurée en fonction de la concentration moyenne (CM) du fluorophore à différentes

températures comprises entre 4 et 70°C, et reportée sur la figure II-11. Une diminution de la fluorescence consécutive à l’auto-extinction du C12NBD-PC en fonction de la concentration est clairement observée. Par exemple à 20°C, l’intensité de fluorescence spécifique de la sonde à 3 mol% est trois fois plus élevée que celle de la sonde à 9 mol%. On constate que cet effet est moins prononcé à de plus hautes températures à cause de l’environnement plus

polaire de la sonde, comme expliqué dans le paragraphe précédent. Les points

expérimentaux peuvent être présentés sous la forme de fonctions exponentielles (Brown et al., 1994),

I = I0.e^-αC, avec C = CM = CL pour des membranes lipidiques homogènes (1)

Dans la figure II-11, I et I0 sont exprimées en a.u. par µM de C12NBD-PC, et C en mol%. Les valeurs correspondantes pour I0 et α sont données dans le tableau 2. L’intensité de fluorescence spécifique émise I permet de remonter à la valeur de C :

C (I) = 1/α ln (I0/I) (2)

Les courbes de calibration exprimant l’intensité de fluorescence du C12NBD-PC en fonction de sa concentration, et leurs fonctions associées vont donc pouvoir être utilisées afin de donner accès aux concentrations locales CL en C12NBD-PC au niveau des membranes de composition hétérogène (PC/SM/Chol) dans lesquelles il est attendu que la concentration moyenne CM est différente de la concentration locale CL, d’après la mesure de la fluorescence spécifique du C12NBD-PC dans ces membranes hétérogènes.

0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 CM [ mol % ]

I

Figure II-11. Intensité de fluorescence spécifique du C12NBD-PC dans des membranes

homogènes de LUVs de composition PC/SM 2:1 mol/mol en fonction de la concentration moyenne (CM) du fluorophore à différentes températures comprises entre 4° et 70°C. Les points expérimentaux peuvent s’exprimer avec une fonction exponentielle (Brown et al., 1994). Le tracé des lignes qui se croisent donne la valeur d’une concentration locale (CL) inconnue correspondant à une intensité de fluorescence spécifique I obtenue expérimentalement. L’exemple indiqué ici concerne la valeur I expérimentale obtenue pour des LUVs composées de PC/SM 2:1 et 20 mol% Chol à 4°C. I = 37.16 a.u./µM, et CL =CM (I)

T I0 [a.u. / µM of PC*] α [1 / mol%] R² 4 88.705 0.1901 0.9824 20 65.672 0.1746 0.9743 37 41.695 0.16 0.9697 50 30.058 0.1558 0.9612 70 17.769 0.1481 0.9497

Tableau 2. Paramètres des courbes de calibration, I (C) = I0.e^-αC tirés des données expérimentales exposées dans la figure II-11 pour la fluorescence spécifique du C12NBD-PC dans des membranes de LUVs homogènes composées de PC/SM, 2:1 mol/mol, en fonction de la concentration moyenne en fluorophore, CM = CL = C [mol %], à différentes températures. R² est le coefficient de corrélation. L’intensité de fluorescence I, donne accès à la valeur de C, dans le cas où C = C (I) = 1/α ln (I0/I).

II.4 Fluorescence du C12NBD-PC dans des membranes