Les analyses chromatographiques sont réalisées sur un système analytique DIONEX Ultimate 3000 équipé d’un dégazeur, d’une pompe tertiaire (système RS), d’un passeur automatique (WPS-3000RS) et d’un détecteur de fluorescence (FLD-3100) piloté par le logiciel d’acquisition « Chromeleon ».
La colonne utilisée est une phase inverse Beckman Coulter Ultrasphère ODS C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) protégée par une pré-colonne remplie de la même phase. Le débit est fixé à 0,7 mL/min et le volume d’injection à 5 µL. Le solvant A est un mélange d’eau ultrapure et d’acide trifluoroacétique (0,1 %) (95:5, v/v) et le solvant B un mélange d’acétonitrile (65 %) et d’acide trifluoroacétique (95:5, v/v). Le gradient d’élution est présenté ci-après (Tableau 8).
Tableau 8. Gradient d’élution pour l’identification et le dosage des flavan-3-ols du moût
et du vin blanc
Temps (min) 0 30 35 40 41 46
Tableau 9. Paramètres des courbes de calibration des flavan-3-ols pour leur dosage dans le moût et
dans le vin blanc par CLHP-FL. Coefficient de variation, taux de recouvrement, coefficient de détermination et gamme de validation
Composé CV % (n = 5) Courbe de calibration R 2 Gamme de linéarité Limite de détection a Limite de quantification a Taux de recouvrement a Moût (+)-Catéchine 3,0 y = 1,917 x 0,993 0,21-100 0,07 0,21 113 (-)-Epicatéchine 4,3 y = 2,575 x 0,990 0,25-100 0,07 0,25 93 B1 5,2 y = 1,806 x 0,997 0,24-10 0,19 0,24 96 B2 4,8 y = 0,642 x 0,999 0,28-10 0,21 0,28 94 Vin (+)-Catéchine 1,2 y = 1,688 x 0,997 0,23-100 0,06 0,23 100 (-)-Epicatéchine 1,7 y = 1,607 x 0,998 0,21-100 0,06 0,21 100 B1 1,7 y = 0,582 x 0,996 0,12-10 0,12 0,27 100 B2 1,4 y = 0,602 x 0,998 0,13-10 0,13 0,29 100
a La limite de quantification et la gamme de linéarité sont exprimées en mg/L tandis que le coefficient de détermination et le taux de recouvrement sont en pourcentage (%)
5.3 COURBES DE CALIBRATION, REPETABILITE ET SENSIBILITE DE LA METHODE
DE DOSAGE DES FLAVAN-3-OLS DANS LE MOUT ET LE VIN
Le dosage des flavan-3-ols dans le moût et le vin a été effectué par étalonnage externe. Les gammes d’étalonnage ont été établies aux longueurs d’ondes suivantes : pour l’excitation λex = 275 et pour l’émission λem = 322 en utilisant les standards commerciaux.
La gamme d’étalon du vin est préparée en ajoutant à une solution méthanolique des concentrations croissantes en (+)-catéchine et (-)-épicatéchine : de 1 mg/L à 100 mg/L et en B1 et B2 : de 0,5 mg/L à 10 mg/L. Comme le montrent les résultats présentés dans le Tableau 9, une corrélation linéaire est observée après le calcul du coefficient de détermination, entre la concentration des flavan-3-ols et la surface des signaux de détection.
La gamme d’étalonnage des flavan-3-ols dans le moût a été réalisée en ajoutant des concentrations croissantes en (+)-catéchine et (-)-épicatéchine : de 1 mg/L à 100 mg/L et en procyanidines B1 et B2 : de 0,5 mg/L à 10 mg/L. Ces échantillons ont alors été extraits puis analysés selon le protocole expérimental décrit préalablement. Une corrélation linéaire est ainsi observée, après le calcul du coefficient de détermination, entre la concentration en flavan-3-ols dans les extraits organiques du moût et la surface des signaux (Tableau 9).
Pour les deux méthodes de dosage des flavan-3-ols, la répétabilité a été déterminée à partir de l’analyse d’un même échantillon de moût blanc et de vin répétée cinq fois. Le coefficient de variation du dosage pour chaque composé est précisé dans le
Tableau 9. Il est toujours inférieur à 10 %.
Le Tableau 9 indique aussi les limites de détection et de quantification des flavan-3-ols dans les deux matrices, moût et vin. Elles sont définies comme la
des moûts et vins blancs issus de différents millésimes et appellations
Matrice Cépage Appellation Millésime (+)-Catéchine (-)-Epicatéchine n
Moût
Sauvignon blanc Graves 2007 10,9-29,1 3,0-6,2 6
Sauvignon blanc Pessac Léognan 2007 1,4-2,6 traces 6
Sauvignon blanc Entre Deux Mers 2008 3,3-16,3 3,8-7,8 6
Sauvignon blanc Graves 2008 12,0-28,1 4,9-14,0 6
Sauvignon blanc Pauillac 2008 3,0-43,0 3,0-11,0 6
Sauvignon blanc Entre Deux Mers 2009 1,1-27,0 traces-13,6 15
Sauvignon blanc Pauillac 2009 0,4-35,6 traces-11,6 33
Sauvignon blanc Pessac Léognan 2009 0,3-5,9 traces-2,8 15
Sauvignon blanc a Pauillac 2009 7,1-10,5 7,1-28,1 4
Sauvignon blanc b Pauillac 2009 11,2-20,2 30,1-47,2 4
Riesling Rheingau 2009 1,2-3,4 0,2-0,7 4 Chardonnay Chassagne Montrachet 2009 4,5-10,2 1,5-4,7 3 Vin
Sauvignon blanc Pessac Léognan 1994 1,1-2,5 8,7-9,5 3
Sauvignon blanc Pessac Léognan 2001 3,4-5,1 7,5-8,2 3
Sauvignon blanc Pessac Léognan 2003 14,9-18,5 5,6-7,3 3
Sauvignon blanc Pauillac 1992 1,8-2,6 1,1-1,6 3
Sauvignon blanc Pauillac 2000 11,5-14,5 1,9-2,4 3
Sauvignon blanc Pauillac 2003 1,5-9,8 1,6-3,8 3
Sauvignon blanc Graves 2008 11,1-21,6 traces 6
Sauvignon blanc Entre Deux Mers 2008 traces-11,2 traces 6
Sauvignon blanc Entre Deux Mers 2009 3,0-5,9 2,6-3,1 15
Sauvignon blanc Pauillac 2009 5,3-12,7 2,5-3,8 18
Sauvignon blanc Pessac Léognan 2009 2,2-10,6 traces-2,4 15
Riesling Rheingau 2009 0,1-0,5 0,1-2,5 36
Sauvignon blanc c Sauternes 2009 3,5 nd 2
Sauvignon blanc d Sauternes 2009 0,3 nd 2
Sauvignon blanc e Sauternes 2009 0,1 nd 2
Sémillon c Sauternes 2009 1,1 nd 2
Sémillon d Sauternes 2009 0,7 nd 2
Sémillon e Sauternes 2009 0,1 nd 2
Sauvignon blanc c Loupiac 2010 12,9 3,5 2
Sauvignon blanc d Loupiac 2010 6,4 3,5 2
Sauvignon blanc e Loupiac 2010 2,5 1,3 2
pré-5.4 APPLICATION A L’ANALYSE DE MOUTS ET DE VINS BLANCS
Nous présentons ici à titre d’exemple, le dosage des deux monomères des flavan-3-ols, la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine, réalisé dans des moûts et des vins blancs d’origine et de millésimes différents. Nous notons que les composés B1 et B2 ne sont pas détectés dans les échantillons de moûts et de vins. Ainsi, pour la suite de notre étude nous ne présenterons que les résultats concernant les deux monomères de flavan-3-ols, la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine.
Les teneurs en (+)-catéchine et (-)-épicatéchine des moûts et des vins blancs varient d’un millésime à l’autre mais également d’un cru à l’autre (Tableau 10). Les moûts issus des cépages Sauvignon blanc et Riesling sont plus riches en (+)-catéchine qu’en (-)-épicatéchine. Les teneurs en (+)-catéchine et (-)-épicatéchine dans les moûts fluctuent entre 0,3 mg/L et 43 mg/L et entre 0,2 mg/L à 28 mg/L respectivement. De plus, la macération pré-fermentaire des raisins accroît d’un facteur 2 les teneurs de ces flavan-3-ols dans le moût. Par ailleurs, les teneurs en flavan-3-ols des vins sont inférieures à celles des moûts correspondants. Les vins de Riesling sont moins riches en flavan-3-ols que les vins de Sauvignon blanc. Les teneurs moyennes en (+)-catéchine (7 mg/L) dans les vins sont supérieures à celles en (-)-épicatéchine (2 mg/L). Enfin, les vins liquoreux issus de raisins atteints par Botrytis cinerea contiennent des teneurs beaucoup plus faibles en flavan-3-ols par rapport aux vins blancs secs des mêmes cépages. L’attaque du champignon, vraisemblablement en impliquant la laccase, semble favoriser la dégradation de la (+)-catéchine et de la (-)-épicatéchine.
5.5 CONCLUSION
Le développement d’une méthode de dosage des flavan-3-ols dans les moûts nous a permis de doser par CLHP-FL les teneurs de ces composés qui sont globalement comparables à celles décrites dans la littérature (§ 1.3.2.2). L’optimisation des