Chapitre V) Les Transporteurs Transmembranaires MmpL
2) La famille de régulateur WhiB :
Cette famille de protéines est restreinte aux actinobactéries. Comme la superfamille des TetR, ces protéines sont en charge de la régulation de nombreuses voies métaboliques impliquées dans la réponse à des stress environnementaux, des changements morphologiques et au coursdes différentes phases de croissance. Ces gènes ont été identifiés il y a presque 50 ans grâce à l’observation microscopique de colonies blanches (whi pour « white mutants ») ou grises de S.
coelicolor capables ou incapables de sporuler respectivement (Chater 1972). C’est donc la fonction
de sporulation chez cette bactérie gouvernée par le gène whiB qui a d’abord été étudiée dans le détail.
Figure 37. Alignement des séquences d’acides aminés de WhiB7 de mycobactéries. Alignements protéiques de WhiB7 de M. tuberculosis, M. abscessus et M. smegmatis mettant en avant le caractère conservé de la partie C-terminale. Les résidus marqués d’un astérisque (*) sont ultra-conservés, comme les 4 cystéines du cluster fer-soufre, les glycines, tryptophanes et autres acides aminés composant le domaine GW rich ainsi que les arginines et lysines de l’AT-Hook (Adapté de (Hurst-Hess et al 2017).
Figure 38. Alignement nucléotidique des séquences promotrices contrôlées par WhiB7 chez M. tuberculosis. L’alignement des promoteurs d’eis, de tap et d’erm(37) responsable, respectivement, des résistances aux aminoglycosides, aux rifamycines et aux macrolides révèle l’organisation typique des gènes contrôlés par WhiB7. Un motif riche en AT en orange, situé à 3 nucléotides de la boite -35 en rouge. La boite -10 est colorée en bleu, et est située à 17-18 nucléotides de la boite -35 (Adapté de Burian et al. 2012).
2a) Propriétés génétiques :
Des paralogues de ces gènes whiB ont ensuite été identifiés au sein d’autres genres bactériens, comme chez les mycobactéries. Que ce soit chez les streptomycètes ou les mycobactéries, les gènes whiBont une taille comprise entre 250 et 400 pb. Chez M. tuberculosis, 7 gènes de type whiB ont été identifiés contre 6 chez M. abscessus. A l’inverse des mmpL et des tetR, le nombre de gènes whiB ne paraît pas être relié à la capacité d’adaptation, étant donné que M. leprae possède 5 homologues potentiels sur son génome (Morris et al. 2005).
2b) Propriétés biochimiques et structurales :
Ces gènes de tailles réduites produisent des polypeptides de petites tailles, 94 acides aminés pour le WhiB7 de M. abscessus. Ces protéines sont partiellement très conservées parmi les mycobactéries mais également au sein d’autres genres comme Rhodococcus et Streptomyces (Hurst-Hesset et al 2017). La région N-terminale est moins conservée et de taille variable que le reste de la protéine qui est appelée « core sequence » (Figure 37). Cette core sequence est composée d’un cluster fer-souffre où quatre résidus cystéines sont absolument conservés dans toutes les séquences. Ces cystéines sont capables de lier deux ou quatre atomes de fer et deux ou quatre de soufre ([2/4Fe – 2/4S]) en fonction de leur état oxydatif (Ramón-García et al. 2013). Si ce cluster fer-soufre ne lie aucun de ces deux atomes, les cystéines vont former des ponts intramoléculaires provoquant un réarrangement structural avec un impact sur la fonction de régulation. Les formes [2/4Fe – 2/4S] ne sont pas forcément les configurations protéiques capables de lier l’ADN et inversement. On retrouve ensuite une partie riche en glycine – tryptophane (GW-rich) et la partie responsable de l’interaction, de l’hameçonnage de domaines riches en adénosine et thymine de l’ADN cible (AT-Hook). Ces motifs sont tous les deux hautement conservés. Le domaine GW-rich forme un feuillet bêta qui sera en contact avec les acides aminés chargés positivement composant l’AT-Hook, des arginines et des lysines. Ce domaine de liaison en C-terminal attribue classiquement une fonction d’activateur au système à un composant. Cependant, chez M. tuberculosis, les protéines WhiB peuvent être des répresseurs comme par exempleWhiB1 ou des activateurs comme WhiB2, 3, 4 et 7 (Burian et al. 2012). Les protéines WhiB activatrices vont alors interagir avec différents facteurs sigmas (σ). La préférence pour tel ou tel facteur σ est liée à l’architecture du promoteur en amont du gène (Newton-Foot et Gey van Pittius 2013). Ces protéines WhiB se lieraient aux parties C-terminales de leurs facteurs σ respectifs etcatalyseraient la transcriptiondes régulons par l’ARN polymérase. La taille et la séquence de ces motifs riches en AT sont variables d’un gène et d’une espèce à l’autre. En règle générale, ils sont composés de 5-6 pb situés à 3 nucléotides en amont de la boîte hexamèrique
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2c) Rôles et fonctions :
Chez M. abscessus, c’est le gène whiB7 qui est principalement étudié étant donné son implication dans les processus de multi-résistances intrinsèques aux antibiotiques. Deux études récentes rapportent l’enrôlement de WhiB7 dans la résistance de M. abscessus à l’AMK, à la CLR, à la TGC mais aussi à la TBM, à la gentamicine et au chloramphénicol (Hurst-Hess et al 2017)(Pryjma et al. 2017). Des études de RNA-seq comparant l’expression des gènes entre une souche sauvage et un mutant ∆whiB7 ont révélé que le régulon de whiB7 s’étend à plus de 120 gènes, suggérant un rôle global de WhiB7 dans l’homéostasie de cette MNT (Hurst-Hess et al 2017). Pryjma et al. proposent un antagonisme in vitro entre la CLR avec l’AMK à des doses subinhibitrices. En effet une faible concentration de CLR induit une résistance croisée à l’AMK.
En revanche chez M. tuberculosis, les fonctions des 7 gènes whiB sont connues. Plusieurs de ces protéines partagent des rôles similaires comme dans la virulence au sein du macrophage ainsi que les différentes phases de croissance et la persistance. C’est le cas par exemple de WhiB1, 2 et 3 qui sont surexprimés lors de la phase stationnaire.
WhiB1 est également impliqué dans la survie intramacrophagique et la possible réactivation des bacilles après une infection latente (Smith et al. 2010). En effet, WhiB1 contrôle l’expression du gène rpfA, un facteur de croissance nécessaire à la sortie de la phase de latence (Kana et al. 2008).
WhiB2 est aussi surexprimé en phase stationnaire ainsi qu’en carence de nutriments et en présence de molécules ciblant la paroi mycobactérienne comme l’EMB (Geiman et al. 2006).
WhiB3 s’active également lors d’un stress nutritif et oxydatif que l’on retrouve en phase de latence (Singh et al. 2007). Il catalyse aussi l’anabolisme de lipides nécessaires à la pathogénicité de
M. tuberculosis dans le macrophage via l’utilisation du propionate pour la synthèse de certains
glycolipides comme le DAT (Singh et al. 2009).
WhiB4 est lui exprimé tout au long des phases de croissance et joue un rôle dans la virulence mais aussi dans la dissémination de l’infection. Un mutant ∆whiB4 montre une hypervirulence dans le système pulmonaire mais un défaut de dissémination des bactéries jusqu’à la rate chez un modèle murin (Chawla et al. 2012).
WhiB5 est quant à lui seulement exprimé en phase exponentielle de croissance mais semble répondre à des agents provoquant un stress membranaire (Geiman et al. 2006). Comme WhiB1, cette protéine aurait un rôle dans la réactivation et la reprise de croissance après une infection latente (Casonato et al. 2012). Le régulon de WhiB5 est important puisqu’il contient au moins 58 gènes identifiés. Parmi ses candidats, on retrouve les gènes codant les systèmes de sécrétion de
Figure 39. Modèle de prédiction d’interaction du complexe WhiB7 – SigA lié à l’ADN cible. L’interaction du résidu Glu61 de WhiB7 avec le résidu Arg515 de la région 4,2 C-terminale de SigA a été déterminée expérimentalement. La région N-terminale, le cluster fer-soufre, l’AT-Hook et la région intermédiaire située en ces deux derniers domaines sont colorés en gris, rouge, bleu et rose respectivement. La région 4 du facteur SigA d’E. coli a été utilisée dans ce modèle et est colorée en doré (PDB : 4IGC_X)(Adapté de Burian et al. 2013).
type VII ESX-2 et ESX-4, des protéines nécessaire à la survie au sein de cellules dendritiques et de macrophages (Mendum et al. 2015).
WhiB6 est aussi surexprimé en conditions de stress membranaire par exemple après exposition au SDS, à de l’éthanol et après un choc thermique (Geiman et al. 2006). Cette protéine semble aussi activer l’expression d’un système de sécrétion de type VII, cette fois-ci ESX-1 (Wiseman et al. 2010). ESX-1 est responsable de la sécrétion d’antigènes majeurs liés à la virulence de M.
tuberculosis. Les pertes de virulence des souches de M. bovis BCG et M. microti utilisées dans les
vaccins anti-tuberculeux sont liées à des mutations dans locus d’esx-1 (Pym et al. 2002).
Le rôle de WhiB7 est identique chez M. abscessus et chez M. tuberculosis. Une approche biochimique a permis de montrer que WhiB7 interagit avec la partie C-terminal du facteur végétatif SigA pour améliorer le niveau de transcription des gènes cibles (Burian et al 2013)(Figure 39). Cette interaction serait due à la région située entre le cluster fer-soufre et l’AT-Hook. L’activation n’est pas uniquement dépendante de la présence d’antibiotiques ciblant le ribosome. Ce régulateur s’active au moment de l’entrée en phase stationnaire ou en absence de fer, comme par exemple à l’intérieur d’un phagosome (Homolka et al. 2010). Des conditions entraînant une réduction du potentiel redox du cytoplasme suivie d’un stress oxydatif peut provoquer en théorie une activation de WhiB7. Burian et al. le démontrèrent simplement en mesurant le niveau d’expression de l’ARNm par qRT-PCR de
whiB7 en présence d’antibiotiques couplés soit à un agent réducteur soit à un agent oxydatif,
respectivement du DiThioThréitol (DTT) ou du diamide. Le DTT couplé à une très faible concentration d’érythromycine augmente fortement le niveau de transcrits de whiB7 alors que le diamide en stoppe la production. Ceci reflète expérimentalement le changement de la balance redox du mycothiol dans le cytoplasme de la bactérie. Le mycothiol est aux actinomycètes ce qu’est le glutathion chez les Gram - et les eucaryotes. C’est un agent réducteur qui permet entre autre de se débarrasser des ROS lorsqu’il est retrouvé en grande quantité sous sa forme réduite. En plus des gènes de résistance présents dans le régulon de whiB7, ce mécanisme d’oxydoréduction participe à la lutte contre les antibiotiques en inactivant la production de radicaux libres que ces antimicrobiens engendrent indirectement (Rawat et al. 2002).
Objectifs Améliorer la compréhension des mécanismes qui régissent l’antibiorésistance intrinsèque chez M. abscessus est primordial pour :
- le développement de nouveaux pharmacophores biologiquement actifs, - la découverte de nouvelles cibles médicamenteuses,
- l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant les antibiotiques dont l’utilisation est déjà approuvée.
Mes travaux de thèse s’inscrivent dans le domaine de la recherche fondamentale. Ces recherches se sont, dans un premier temps, axées sur des transporteurs membranaires impliqués dans l’efflux d’antibiotiques, dont les principaux objectifs ont consisté à :
- identifier les antibiotiques potentiellement expulsés par M. abscessus, - identifier le ou les transporteurs MmpL impliqués dans ce processus, - décrire les mécanismes de régulation de ces pompes à efflux,
- proposer de nouveaux marqueurs de résistance à certains antibiotiques.
Trois études comprenant des approches biochimique, génétique et structurale ont permis de disséquer les mécanismes de résistance basale de trois couples TetR – MmpS/MmpL impliqués dans la résistance à trois classes d’antibiotiques différentes. Nous avons tout d’abord identifié le système MAB_4384 – MAB_4383c/MAB_4382c, responsable de l’export des analogues du TAC (Article 1). Nous avons également décrit et attribué la résistance croisée à la CFZ et à la BDQ à deux couples MmpS/MmpL, les paires MAB_2300/MAB_2301 (Article 2) et MAB_1135c/MAB_1134c (Article 3), toutes deux régulées par le même TetR MAB_2299c.
La deuxième partie de ma thèse a porté sur la résistance inductible aux macrolides chez M.
abscessus. Ce phénomène, encore très mal compris, est d’autant plus problématiqueque les
macrolides sont la pierre angulaire de la thérapie anti – M. abscessus. Les objectifs ont consisté à : - identifier les éléments nécessaires à l’activation de cet événement inductible,
- comparerl’activité antimicrobienne et la cinétique de l’induction de l’AZM et de la CLR, - mettre en évidence et observer ce phénomène de résistance induite dans un modèle
animal, l’embryon de zebrafish.
Nous avons confirmé via une étude génétique et biochimique l’implication de WhiB7 dans l’activation de cette résistance et nous avons également clôturé le débat sur les effets respectifs de l’AZM et de la CLR en démontrant que l’AZM n’est pas un meilleur antibiotique que la CLR in vitro. Ces deux macrolides induisent également la résistancein vivo chez le zebrafish. Ces travaux ont aussi souligné la complexité de cette cascade de régulation qui a pour répercussion un antagonisme entre l’AMK et ces deux macrolides.
Article 1
«
Mechanistic and Structural Insights Into the Unique TetR-Dependant Regulation of a Drug Efflux Pump in Mycobacterium abscessus.» Richard M, Gutiérrez AV, Viljoen A, Ghigo E, Blaise M, Kremer L. Front Microbiol. 2018 Apr 5; Vol 9 Article 649.
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2, 2018 Time: 16:9 # 1 ORIGINAL RESEARCH published: 05 April 2018 doi: 10.3389/fmicb.2018.00649 Edited by: Thomas Dick, Rutgers University, United States
Reviewed by:
Peter Sander, Universität Zürich, Switzerland Kyle Rohde, University of Central Florida, United States *Correspondence: Mickael Blaise mickael.blaise@irim.cnrs.fr Laurent Kremer laurent.kremer@irim.cnrs.fr Specialty section:
This article was submitted to Antimicrobials, Resistance and Chemotherapy, a section of the journal Frontiers in Microbiology
Received: 13 February 2018 Accepted: 20 March 2018 Published: 05 April 2018 Citation:
Richard M, Gutiérrez AV, Viljoen AJ, Ghigo E, Blaise M and Kremer L (2018) Mechanistic and Structural Insights Into the Unique TetR-Dependent Regulation of a Drug Efflux Pump in Mycobacterium abscessus. Front. Microbiol. 9:649. doi: 10.3389/fmicb.2018.00649
Mechanistic and Structural Insights
Into the Unique TetR-Dependent
Regulation of a Drug Efflux Pump in
Mycobacterium abscessus
Matthias Richard1, Ana Victoria Gutiérrez1,2, Albertus J. Viljoen1, Eric Ghigo3, Mickael Blaise1* and Laurent Kremer1,4*
1CNRS UMR 9004, Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier, Université de Montpellier, Montpellier, France,
2Unité de Recherche, Microbes, Evolution, Phylogeny and Infection, Institut Hospitalier Universitaire Méditerranée Infection, Marseille, France,3Centre National de la Recherche Scientifique, Campus Joseph Aiguier, Marseille, France,4Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier, Montpellier, France
Mycobacterium abscessusis an emerging human pathogen causing severe pulmonary infections and is refractory to standard antibiotherapy, yet few drug resistance mechanisms have been reported in this organism. Recently, mutations in MAB_4384 leading to up-regulation of the MmpS5/MmpL5 efflux pump were linked to increased resistance to thiacetazone derivatives. Herein, the DNA-binding activity of MAB_4384 was investigated by electrophoretic mobility shift assays using the palindromic sequence IRS5/L5 located upstream of mmpS5/mmpL5. Introduction of point mutations within IRS5/L5 identified the sequence requirements for optimal binding of the regulator. Moreover, formation of the protein/IRS5/L5 complex was severely impaired for MAB_4384 harboring D14N or F57L substitutions. IRS5/L5/lacZ reporter fusions in M. abscessusdemonstrated increased β-galactosidase activity either in strains lacking a functional MAB_4384 or in cultures treated with the TAC analogs. In addition, X-ray crystallography confirmed a typical TetR homodimeric structure of MAB_4384 and unraveled a putative ligand binding site in which the analogs could be docked. Overall, these results support drug recognition of the MAB_4384 TetR regulator, alleviating its binding to IRS5/L5 and steering up-regulation of MmpS5/MmpL5. This study provides new mechanistic and structural details of TetR-dependent regulatory mechanisms of efflux pumps and drug resistance in mycobacteria.
Keywords: Mycobacterium abscessus, TetR regulator, MmpL, efflux pump, structure, thiacetazone analogs, EMSA
INTRODUCTION
Mycobacterium abscessus is a rapid growing mycobacterium (RGM) that has recently become an important health problem (Mougari et al., 2016). This non-tuberculous mycobacterial (NTM) pathogen can cause serious cutaneous, disseminated or pulmonary infections, particularly in cystic fibrosis (CF) patients. In CF patients, infection with M. abscessus is correlated with a decline in lung function and poses important challenges during last-resort lung transplantation (Esther et al., 2010; Smibert et al., 2016). An epidemiological study has recently documented the prevalence
2, 2018 Time: 16:9 # 2
Richard et al. TetR-Dependent Regulation of MmpL Expression in M. abscessus
and transmission of M. abscessus between hospital settings throughout the world, presumably via fomites and aerosols and uncovered the emergence of dominant circulating clones that have spread globally (Bryant et al., 2016). In addition, M. abscessus exhibits innate resistance to many different classes of antimicrobial agents, rendering infections with this microorganism extremely difficult to treat (Nessar et al., 2012;
van Dorn, 2017). Recent studies have started to unveil the basis of the multi-drug resistance characterizing M. abscessus, uncovering a wide diversity of mechanisms or regulatory networks. These involve, for example, the induction of the erm(41) encoded 23S rRNA methyltransferase and mutations in the 23S rRNA that lead to clarithromycin resistance (Nash et al., 2009), the presence of a broad spectrum β-lactamase that limits the use of imipenem (Dubée et al., 2015; Lefebvre et al., 2016, 2017) or the presence of eis2, encoding an acetyl-transferase that modifies aminoglycosides, specifically induced by whiB7, which contributes to the intrinsic resistance to amikacin (Hurst-Hess et al., 2017;Rominski et al., 2017b). Other studies reported the role of the ADP-ribosyltransferase MAB_0591 as a major contributor to rifamycin resistance (Rominski et al., 2017a) whereas MAB_2385 was identified as an important determinant in innate resistance to streptomycin (Dal Molin et al., 2018).
Recently, we reported the activity of a library of thiacetazone (TAC) derivatives against M. abscessus and identified several compounds exhibiting potent activity against a vast panel of clinical strains isolated from CF and non-CF patients (Halloum et al., 2017). High resistance levels to these compounds were linked to mutations in a putative transcriptional repressor MAB_4384, together with a strong up-regulation of the divergently oriented adjacent locus encoding a putative MmpS5/MmpL5 transporter system. That ectopic overexpression of MmpS5/MmpL5 in M. abscessus also increased the minimal inhibitory concentration (MIC) to analogs of TAC further suggested that these two proteins may act as an active efflux pump which was sufficient to confer drug resistance (Halloum et al., 2017). In addition to uncovering new leads for future drug developments, this study also highlighted a novel mechanism of drug resistance in M. abscessus. Unexpectedly, an important difference relies on the fact that, in M. tuberculosis, MmpS5/MmpL5 acts as a multi-substrate efflux pump causing low resistance levels to antitubercular compounds such as clofazimine, bedaquiline, and azoles (Milano et al., 2009;Andries et al., 2014;Hartkoorn et al., 2014) whereas the M. abscessus strains overexpressing MmpS5/MmpL5 are very resistant to the TAC analogs but fail to show cross-resistance against clofazimine or bedaquiline (Halloum et al., 2017). This implies that, despite their high primary sequence identity, the MmpS5/MmpL5 orthologs from M. tuberculosis and M. abscessus do not share the same substrate specificity. Moreover, whereas Rv0678, the cognate regulator of MmpS5/MmpL5 in M. tuberculosis belongs to the MarR family (Radhakrishnan et al., 2014), MAB_4384 is part of the TetR family of regulators and the change in the transcriptional level of mmpS5/mmpL5 was much more pronounced in the M. abscessus mutants than in the
M. tuberculosis mutants (Milano et al., 2009;Hartkoorn et al., 2014).
The TetR transcriptional regulatory factors are common single component signal transduction systems found in bacteria. These proteins possess a conserved helix-turn-helix (HTH) signature at the N-terminal of the DNA-binding domain as well as a ligand binding domain (LBD) located at the C-terminal part (Cuthbertson and Nodwell, 2013). They often act as repressors and interact with a specific DNA target to prevent or abolish transcription in the absence of an effector. In contrast, the binding of a specific ligand to the LBD induces structural changes, conducting the dissociation of the repressor from the target DNA, and the subsequent transcription of the TetR-regulated genes. Being largely associated with resistance to antibiotics and regulation of genes coding for small molecule exporters, TetR