CHAPITRE VI :
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I. Structure et métabolisme, indications du dosage et
variations physiologiques
1. Structure et métabolisme :
La découverte de la présence dřADN fœtal dans le sang maternel a ouvert de nombreuses perspectives en diagnostic prénatal et lřavènement dřune nouvelle technologie, le NGS (Next Generation Sequencing), a induit une véritable révolution dans ce domaine. Les premières approches de la recherche de cellules fœtales dans le sang maternel ont été des échecs car nous ne disposions pas des Ac spécifiques des cellules fœtales. Le début de lřhistoire actuelle commence en 1997 avec la découverte de la présence dřADN dřorigine fœtale dans le sang maternel par Dennis Lo et son équipe. Il a fallu toute une série dřétudes pour confirmer quřil sřagissait bien dřADN originaire des cellules trophoblastiques, donc fœtal. Il y a bien, en effet, 4 à 35 % dřADN fœtal dans le sang de la mère (en routine, 10 à 15 %) : il sřagit de petits fragments, en moyenne de 140 paires de base. Nous savons désormais quřil en faut au moins 4 % pour obtenir un résultat exploitable en diagnostic.
LřADN fœtal provient essentiellement des cellules syncytio-trophoblastiques et apparaît dans la circulation maternelle aux environs de la 6e semaine dřaménorrhée, sa durée de vie de dans le sang maternel correspond à quelques minutes avant la disparition totale après lřaccouchement ([374],[375]).
2. Indications du dosage :
- Détermination du sexe du fœtus dans le cadre du diagnostic prénatal des maladies héréditaires liées au sexe (hémophilie, myopathie de Duchenne).
- Détermination prénatale du génotype RH:1 fœtal à partir du sang maternel chez les femmes RH: -1.
- Diagnostic prénatal des maladies héréditaires.
- Diagnostic prénatal non invasif (DPNI) de la trisomie 21. Le premier automate mis sur le marché en 2006, de la société Roche (GS20-FLX454), permettait en 6 h lřanalyse de 20 000 000 de paires de base (pdb). Puis sont apparus des concurrents : Solexa 1G Illumina™ et SOLiD ABI™ en 2009 et 2010 ; Ce test est réalisé principalement en Chine ou aux USA.
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3. Variations physiologiques :
La quantité dřADN fœtal varie en fonction de lřâge de la grossesse : 4 à 6 % vers 5 semaines, puis ce pourcentage augmente et lřADN est retrouvé jusquřà lřaccouchement. En pratique, le diagnostic est fait entre 9 et 12 semaines dřaménorrhée [375].
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II. Dosage de l’ADN fœtal circulant :
1. Phase pré-analytique :
[375]Prélèvements : Le prélèvement sanguin sera réalisé idéalement sur tube BCT®; il peut
également être effectué sur tube EDTA, à privilégier par rapport aux tubes héparinés, citratés ou sans anticoagulants.
Conservation : LřADN est stable dans les prélèvements de sang, mais il est préférable de les
traiter dans les 24h car la destruction de cellules sanguines libère de lřADN dans le plasma.
2. Phase analytique :
Lřanalyse de lřADN fœtal requiert une « simple » extraction des acides nucléiques à partir du sang maternel. Toutefois, la quantité dřADN fœtal circulant est très faible, particulièrement au cours du premier trimestre de la grossesse (environ 25 copies/ml de sérum), or cřest précisément durant cette période de la grossesse que le diagnostic prénatal est préférentiellement réalisé.
Lřanalyse de lřADN fœtal circulant est une méthode très sensible mais surtout fiable réservée encore à quelques laboratoires très spécialisés. La technique de choix est indiscutablement aujourdřhui lřamplification génique par PCR en temps réel (avec utilisation de sondes dřhybridations spécifiques) en raison de sa sensibilité et de sa spécificité, mais surtout en raison de lřimportante sécurité dřanalyse quřelle procure (absence de contamination) associée à des procédés automatiques dřextraction des acides nucléiques. La PCR en temps réel a une fiabilité jamais égalée par les méthodes conventionnelles qui devraient être proscrites dans lřanalyse de lřADN fœtal circulant, plus particulièrement celles utilisant une nested-PCR, source de faux positifs [376],[377]. Une étude récente [378] vient de confirmer la grande variabilité des résultats selon les laboratoires, la sensibilité de la détection allant de 31 % pour certains à 97 % pour dřautres.
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III. Apport de l’ADN fœtal circulant pour la pré-éclampsie :
1. Variations de l’ADN fœtal au cours de la pré-éclampsie :
Le nombre de cellules fœtales intactes circulant dans le sang maternel a été évalué à environ 1 cellule/ml de sang et ne peut donc pas expliquer la quantité dřADN fœtal plasmatique et sérique observée. Lřhypothèse que lřétat apoptotique de ces cellules peut être à lřorigine de cet « ADN libre » a donc été évoquée. Sekizawa et al. (2000) [379] ont en effet confirmé quřenviron 50 % des érythroblastes fœtaux présents dans la circulation maternelle sont en état dřapoptose. Le mécanisme par lequel cet ADN fœtal est relargué dans la circulation maternelle nřest pas connu ; la capture et la dégradation au niveau des capillaires pulmonaires de très nombreuses cellules trophoblastiques libérées dans la circulation sanguine utérine pourraient expliquer la grande quantité dřADN fœtal dans le sérum maternel. Le relargage actif à partir des villosités choriales est également une hypothèse plausible [376].
Plusieurs études ont retrouvé des niveaux élevés d'ADN fœtal dans les grossesses compliquées par la PE par rapport aux grossesses normales. Zhong X. et al.[380] ont mesuré les niveaux d'ADN circulant chez des témoins et femmes avec une PE à lřaide de la PCR quantitative et ont montré que l'augmentation des taux d'ADN fœtal était associée à la PE.
2. Apport de l’ADN fœtal pour la pré-éclampsie :
Hahn S. et al. [381] ont suggéré que les niveaux circulants d'ADN fœtal peuvent être utilisés comme facteur prédictif de la pré-éclampsie. Une corrélation de l'ADN fœtal avec les résultats du test de la PAPP-A au premier trimestre de la grossesse a été retrouvée par Lo et
al. (1999) [382]. Cependant, il n'y avait pas d'association entre l'ADN du fœtus et d'autres facteurs pendant le deuxième trimestre. Néanmoins, il n'est toujours pas clair si l'augmentation des niveaux d'ADN fœtal est la cause ou la conséquence de la pré-éclampsie.
Scharfe-Nugent et al. [383] qui ont démontré que l'injection de concentrations élevées d'ADN fœtal induit une inflammation et des symptômes similaires à la PE chez la souris ont également discuté cette question. D'autres recherches sont nécessaires pour déterminer la principale cause de la pré-éclampsie et le rôle de l'ADN fœtal dans sa pathogenèse.
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