1.1.2.2 Extraction de l’ADN à partir des échantillons anciens

A partir de la poudre obtenue après cryobroyage des tissus durs anciens nous pouvons procéder à l’extraction d’ADN. Cette étape est critique dans le processus de traitement des échantillons car il s’agit d’obtenir un rendement maximal d’extraction puisque l’ADN n’est parfois présent qu’en très faible quantité au sein du prélèvement. L’étape de purification associée à l’extraction doit également permettre d’éliminer les éventuels inhibiteurs présents dans l’échantillon.

La méthode utilisée dans cette étude est la suivante. La première étape du protocole consiste en une décalcification et une lyse des échantillons. Pour cela 150 à 200 mg de poudre sont placés dans un tampon constitué de : 500 µl d’EDTA à 0,5M (chélateur des ions calcium), 50 mg de protéinase K à 20 mg.ml-1 et 5 µl de DTT à 1M (agent réducteur). L’ensemble est placé une nuit sous agitation à 50°C. La seconde étape consiste à purifier l‘ADN. Pour cela le kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up commercialisé par la société Macherey Nagel a été utilisé. Ce kit est destiné à la purification directe des produits de PCR ou à partir de gels d’agarose. Il a la propriété de purifier des petits fragments d’ADN (jusqu’à 50 pb), idéal donc pour la purification d’ADN dégradé comme c’est souvent le cas avec l’ADN extrait des échantillons anciens. Le principe de la purification est basé sur l’utilisation d’une colonne avec une matrice de silice. L’ADN est mélangé à un tampon contenant des sels chaotropiques permettant la fixation de l’ADN sur la membrane de silice puis les éléments indésirables issus de la lyse sont éliminés par des lavages successifs à base d’éthanol. Enfin, l’ADN est élué dans 250 µl d’eau ultrapure. Les extraits sont ensuite purifiés et concentrés par ultrafiltration grâce aux colonnes Amicon Ultra 0.5 ml 30 KDa, (Millipore). Le volume final d’extrait est ainsi de 50 µl.

II.1.2 Les analyses génétiques réalisées

A partir des extraits d’ADN, nous avons pu réaliser différentes analyses génétiques. Une stratégie expérimentale particulière a été mise en place afin de répondre aux différentes problématiques de recherche tout en consommant le moins d’ADN possible puisque les substrats anciens disponibles étaient limités. Plusieurs marqueurs ont été étudiés, des marqueurs à transmission uniparentale c’est-à-dire hérités uniquement de la mère ou du père localisés sur l’ADN mitochondrial et la région non recombinante du chromosome Y ainsi que des marqueurs à transmission biparentale localisés sur les autosomes.

II.1.2.1 La détermination du sexe de l’individu

La détermination génétique ou moléculaire du sexe des individus va permettre de compléter et de confirmer les données anthropologiques quand celles-ci sont disponibles. En effet, la diagnose sexuelle est parfois difficile à établir lorsque les restes osseux sont très fragmentés et mélangés, ou lorsque les individus sont immatures. Dans ces cas précis, la détermination du sexe apportera des éléments essentiels à l’étude du recrutement funéraire

La technique choisie est celle utilisée en médecine légale qui consiste à amplifier une région du gène de l’amélogénine. L’amélogénine intervient dans la synthèse de l’émail dentaire. Le gène codant cette protéine est présent sur les chromosomes sexuels (AMGX et AMGY) avec, sur le chromosome X une délétion de 6pb par rapport au chromosome Y (Sullivan et al., 1993). Ainsi l’amplification de cette région donnera des profils électrophorétiques différents pour un homme et une femme. Les amorces utilisées sont proches de la région délétée et permettent l’amplification d’un fragment de 112 pb sur le chromosome Y et de 106 pb sur le chromosome X. La détection de deux fragments à 106 pb indique que l’individu testé est féminin (XX) alors que la détection d’un fragment à 106 pb et d’un second à 112 pb indique qu’il est masculin (XY). Ces amorces sont présentes dans tous les kits d’identification génétique commercialisés et permettent ainsi de disposer d’une empreinte ou profil génétique avec le sexe de l’individu analysé.

Les résultats erronés sont rares avec cette méthode mais néanmoins parfois observés notamment dans certaines populations, du fait de délétions (Cadenas et al., 2007) ou lorsque l’ADN analysé est présent en trop faible quantité ou est très dégradé (Quincey et al., 2013), amenant ainsi des pertes d’allèles (dropout en anglais). C’est pourquoi, afin d’augmenter la fiabilité de la détermination du sexe, des marqueurs spécifiques du chromosome Y sont inclus dans les nouveaux kits d’identification, par exemple dans le kit GlobalfilerTM commercialisé par la société Life technologies.

II.1.2.2 Etablissement du profil génétique des individus

Un profil génétique est généralement établi à partir de l’amplification simultanée de STR (Short Tandem Repeats) autosomaux. Les STR sont des polymorphismes de longueurs, c’est- à-dire des répétitions de motifs de quelques paires de bases. Ce nombre de répétitions peut varier d’un individu à l’autre. L’allèle obtenu correspondra ainsi au nombre de répétitions. C’est le nombre de STR analysés qui va permettre d’obtenir un pouvoir de discrimination plus ou moins fort assurant l’unicité de chaque profil. Dans ce travail, le kit AmpFLSTR® Identifiler® Plus (Life technologies), employé dans les investigations médico-légales, a été utilisé pour l’établissement des profils génétiques. Il permet l’amplification simultanée de 15 STR autosomaux (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA) ainsi que du locus de l’amélogénine conférant un pouvoir de discrimination de 5.01x10-18 quand l’ensemble des marqueurs a pu être analysé.

Ces marqueurs étant localisés sur les autosomes, chaque individu possède pour chaque locus 2 allèles, l’un provenant de son père et l’autre de sa mère. L’étude de ces marqueurs permet donc également d’étudier les liens de proches parentés.

Dans ce travail, la réaction d’amplification a été réalisée à partir de 5 µl d’ADN dans un volume final de 12.5 µl. Le protocole suivi est celui recommandé par le fabricant à l’exception du nombre de cycles qui est augmenté de 28 à 32. L’analyse des produits PCR est réalisée par électrophorèse capillaire sur un séquenceur automatique 3500 Genetic Analyser (Life technologies). Les résultats sont analysés à l’aide du logiciel Gene Mapper v4.1 (Life technologies).

II.1.2.3 Détermination

des

haplotypes

et

des

haplogroupes

mitochondriaux et du chromosome Y

Contrairement aux marqueurs autosomaux, les marqueurs localisés sur l’ADN mitochondrial et sur la région non recombinante du chromosome Y sont à transmission uniparentale. L’ADN mitochondrial se transmet de la mère à ses enfants (filles et garçons) et le chromosome Y se transmet uniquement de père en fils. Ainsi l’analyse de ces marqueurs permet d’étudier les lignées maternelles et paternelles des individus. L’étude de ces lignées se fera par la détermination des haplotypes ainsi que des haplogroupes Y et mitochondriaux, deux notions employées fréquemment dans ce manuscrit et définies ci-après.

L’haplotype

Un haplotype correspond à une combinaison de mutations présentes sur une même région d’intérêt (l’ADN mitochondrial) ou sur un même chromosome (chromosome Y). Les polymorphismes concernés peuvent être aussi bien des polymorphismes ponctuels de séquence (SNP : Single Nucléotide Polymorphism), des insertions/délétions ou encore des polymorphismes de longueurs (STR). Les individus partageant la même signature génétique sur l’ensemble de ces sites polymorphes portent alors le même haplotype. L’haplotype mitochondrial est défini par des SNP alors que l’haplotype du chromosome Y est défini par des STR. Ces haplotypes peuvent être regroupés au sein de grands groupes appelés haplogroupes.

L’haplogroupe

Un haplogroupe regroupe les haplotypes dérivant d’un même ancêtre commun. Les haplotypes appartenant au même haplogroupe partagent ainsi souvent des mutations en commun dans le cas de l’ADN mitochondrial. Concernant le chromosome Y, si l’haplotype est ici défini par les allèles présents au niveau de différents loci STR, l’haplogroupe lui est généralement défini par un SNP. Ces haplogroupes ayant le plus souvent des répartitions géographiques spécifiques, leur étude rend possible la détermination de l’origine biogéographique d’un individu. Aujourd’hui, les avancées technologiques ont permis d’affiner considérablement la phylogénie, entraînant des modifications fréquentes des noms des haplogroupes (principalement des sous-haplogroupes, la désignation des macro- haplogroupes restant constante). Ces noms sont construits par l’enchainement de lettres et de chiffres. Les haplogroupes du chromosome Y étant défini par des SNP, nous associerons toujours le nom du SNP à l’haplogroupe pour faciliter la compréhension en dépit de l’évolution constante de la nomenclature.