De cette façon : PI = 0 lorsqu’il n’y a pas d’inhibition (l’activité résiduelle vaut alors 100 %) et tend vers l’infini lorsque l’activité résiduelle tend vers 0.
La méthode polarographique présente généralement un domaine de linéarité large, une bonne sensibilité et une bonne reproductibilité lorsque les activités enzymatiques mesurées sont élevées (Palmieri et al., 1987). Par ailleurs, cette méthode, par rapport aux mesures d’activité enzymatique par spectrophotométrie, présente l’avantage de suivre spécifiquement la consommation d’oxygène c’est-à- dire la vitesse de disparition d’un substrat et donc uniquement l’activité enzymatique, et non pas la résultante qu’est le brunissement enzymatique dans le cas par exemple des mesures de l’activité PPO.
1 (%) résiduelle
activité 100
Par ailleurs cette méthode polarographique limite les biais de mesure liés à l’introduction des PRM dans la cellule de mesure qui pourrait biaiser les résultats.
L’estimation des paramètres cinétiques des catalyses enzymatiques (Vm, Km) et des inhibitions (Kiapp)
ont été réalisées à l’aide du logiciel GraFit Version 4.06 (© Erithacus Software Limited) à partir d’au moins trois mesures d’activité enzymatique pour chaque concentration en substrat. En dehors des études cinétiques, les valeurs d’activité résiduelle ou de pouvoir inhibiteur correspondent à la moyenne arithmétique calculée sur au moins trois mesures expérimentales. Les barres d’erreur correspondent alors aux écarts-types calculés pour ces mesures.
3.1.1. Mesure de l’activité PPO
Pour les dosages d’activité PPO, le 4-méthylcatéchol a le plus souvent été utilisé comme substrat. Le cas échéant, l’utilisation d’un autre substrat est indiquée. Afin d’étudier les différentes PPO dans des conditions proches de leurs optima tout en limitant l’auto-oxydation partielle des substrats, les mesures d’activité ont été réalisées à pH 4,5 pour la PPO de pomme, de pomme de terre et la tyrosinase de champignon et à pH 5,0 pour la PPO d’aubergine. La quantité d’extrait enzymatique injectée en cuve ne doit pas contenir une activité supérieure à 25 nkat afin que la pente mesurée reste proportionnelle à la quantité d’enzyme présente dans le milieu. L’activité PPO introduite en cuve se situe généralement autour d’une valeur de 8 nkat.
3.1.2. Préparation du substrat et dosage de l’activité LOX
Le protocole de préparation du substrat est celui défini par Surrey, (1964). Il consiste en une dispersion d’acide linoléique en phase aqueuse à l’aide de Tween 20. Du Tween 20 (0,55 g) est dispersé dans 10 mL d’une solution de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 6,5. Afin de disperser l’acide linoléique (0,56 g) qui est ajouté ensuite, la solution est fortement agitée. De la soude 1 N est ensuite ajoutée jusqu’à l’obtention d’une solution complètement limpide qui est finalement ajustée à 200 mL avec une solution de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 6,5. Cette solution se conserve 3 jours à 4 °C à l’abri de l’air et de la lumière. Juste avant son utilisation, le substrat est dilué au ½ dans la solution de tampon phosphate de sodium (0,1 M ; pH 6,5) pour obtenir une émulsion d’acide linoléique à 5 mM.
L’activité LOX est dosée comme l’activité PPO par la mesure polarographique de la consommation d’oxygène à 30 °C. Elle est exprimée en nkat ou en nkat par mL de solution enzymatique.
Il est à noter que la présence d’un inhibiteur dans les extraits enzymatiques de LOX provenant de la farine de fève (C50 et GF), conduit à une absence de proportionnalité entre la quantité d’enzyme
introduite en cuve et l’activité enzymatique mesurée pour des valeurs supérieures à 20 µ L d’enzyme en cuve (figure 24). Ainsi, les volumes d’extrait enzymatique de LOX non purifié (C50) et purifié (GFd)
utilisés ont été de 20 et 10 µ L respectivement et correspondant à une activité de 2 et 3 nkat dans le milieu réactionnel de mesure de l’activité enzymatique.
Figure 25 : Activité LOX de fève (nkat) en fonction du volume d’enzyme mis en cuve (µL) pour les deux extraits enzymatiques de farine de fève utilisés (C50 : ○ et GFd : □) – Mise en évidence d’une relation non linéaire pour des volumes supérieurs à 20 µL
y = 0,21x + 0,9 R2 = 0,96 y = 0,09x + 0,32 R2 = 0,97 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60
volume de LOX introduit dans le milieu réactionnel (µL)
a c ti v it é L O X ( n k a t) C50 GFd
3.2. Dosage des protéines
Au cours des étapes de purification des activités enzymatiques, afin de pouvoir établir le tableau de purification et déterminer le taux et le rendement de purification, la quantité de protéines contenue dans chaque extrait enzymatique est dosée selon la méthode de Bradford (1976) à l’aide du réactif commercialisé par la société Bio-Rad. Cette technique permet de doser des quantités de protéines comprises entre 20 et 140 µg pour la méthode standard, et entre 2 et 9 µg pour la micro-méthode. Le dosage consiste dans un premier temps à ajouter 800 µL d’échantillon convenablement dilué à 200 µL de réactif de Bradford (méthode standard). Le mélange, après homogénéisation, est ensuite placé 15 min à l’obscurité, et l’absorbance finalement mesurée à 595 nm (Hewlett Packard 8453) contre de l’eau ultrapure. Les concentrations protéiques ont été calculées par interpolation linéaire à partir d’une gamme étalon contenant de l’albumine de sérum bovin.
Cette méthode présente l’inconvénient d’être incompatible avec de trop fortes concentrations en sels et notamment en sulfate d’ammonium largement utilisé au cours des procédés de purification. Cependant, cette méthode présente un avantage majeur par rapport à la méthode de dosage des protéines par mesure de l’absorbance à 280 nm décrite Layne, (1957). En effet, la présence de contaminants ayant une absorption à 280 nm ou proche de cette longueur d’onde biaise la détermination de la quantité de protéines. Parmi ces contaminants présents dans les extraits enzymatiques, on retrouve notamment les acides nucléiques (forte absorbance dans l’UV, avec un maximum autour de 254 nm) mais ce sont surtout les polyphénols (absorbance maximale comprise entre 260 et 330 nm) qui altèrent les calculs de rendement de purification lorsque la méthode spectrophotométrique est utilisée.
3.3. Détermination des masses moléculaires
Deux mélanges de marqueurs moléculaires ont été préparés dans une solution de tampon phosphate 0,1 M à pH 7. Ils sont injectés en tête de la colonne de gel Sephacryl S-200 HR (FPLC), et sont élués avec une solution du tampon phosphate 0,1 M, pH 7.
Un des mélanges contient 1 mg.mL-1 du bleu Dextran (2,000 kDa), 10 mg.mL-1 ribonucléase A
(13,7 kDa), 10 mg.mL-1 d’albumine serum bovine (BSA, 67 kDa). Le second mélange contient
10 mg mL-1 ovalbumine (43 kDa), 10 mg.mL-1 d’alcool-deshydrogénase (ADH, 140 kDa) et 10 mg.mL-1
catalase (240 kDa). Les résultats sont exprimées en Kav, coefficient qui définit le comportement d’une
protéine indépendamment des dimensions du gel ou du remplissage de la colonne. Ce coefficient est déterminé grâce aux volume d’élution de de chacune des protéines de calibration selon l’équation 3 :
Équation 3 : Expression du Kav des protéines