Expression in vivo de la dystrophine tronquée-EGFP dans la souris mdx/mdx

3.2.1.1 Les plasmides d’expression

Le plasmide pCR3.1EGFPcDNADMDLe plasmide pCR3.1EGFPcDNADMD qui contient le cDNA complet de la

dystrophine humaine a été produit par notre laboratoire [172] à partir de pCR3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les cDNA EGFP provenant du plasmide pIRES-EGFP (Clonetech, Palo Alto, CA) et cDNA DMD provenant du plasmide pRSVDMD.1 (Dr Karpati, Montréal, QC, Canada) ont été insérés dans le plasmide pCR31 sous un promoteur CMV après une série d’amplifications par PCR et des ligations pour produire le plasmide pCR3.1EGFPcDNADMD de 16831 pb (Figure 9). Dans ce plasmide, la séquence codante du gène DMD est fusionnée à celle de la protéine fluorescente EGFP. On trouve également deux sites de restriction uniques SwaI et BspEI situés dans les exons 46 et 67 respectivement.

Figure 9: Le plasmide d’expression pCR3.1EGFPcDNADMD.

1. Transfection des myoblastes d’un patient DMD avec les plasmides pBSU61-50/5-54, pBSU62-50/2-54 et

pX458

Les oligonucléotides simple brin pour les gRNA1-50, gRNA2-50, gRNA2-54 et gRNA5-54 ont été produits par Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Les oligonucléotides simple brin sens et anti-sens de chaque gRNA ont été ensuite transformés en oligonucléotides double-brin (annealing) et ont été insérés séparement dans le plasmide d’expression pBSU6 (pBSU6_FE_ScaffoldRSV_GFP, don de Dr. Dirk Grimm, Heidelberg University, Germany) après sa double digestion avec BbsI et BsmBI (NEB, Inc., Ipswich, MA) pour produire les plasmides pBSU61-50/5-54, pBSU62-50/2-54. Le plasmide pX458 (pSpCas9-FLAG (BB)-2A-GFP) (don de Feng Zhang, Addgene, Cambridge, MA) code pour le gène de la SpCas9.

Les myoblastes d’un patient DMD avec une délétion des exons 51-53 ont été cultivés dans le milieu MB-1 (GE, Hyclone laboratories, Logan, UT) avec 15% de FBS (fetal bovin serum) sans antibiotique à 37°C sous 5% de CO2 dans les plaques de 6 puits à raison de 105 _{cellules par puits. La transfection des plasmides}

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pBSU61-50/5-54 et pX458 d’une part et pBSU62-50/2-54 et pX458 d’autre part a été réalisée avec l’agent de transfection Transfex (ATCC, Cedarlane, ON, Canada) lorsque les myoblastes ont atteint une confluence de 70-80%. Deux jours après la transfection, le milieu MB-1 a été aspiré et remplacé avec le milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) (Corning, Manassas, VA) avec 2% de FBS, sans antibiotique pour permettre la différenciation des myoblastes en myotubes. Une semaine plus tard, les myotubes ont été récoltés avec la trypsine et lavés avec HBSS (Hanks balanced saline solution). Les myotubes ont été ensuite utilisés pour l’extraction de l’ARNm.

2. Extraction de l’ARNm et RT-PCR

L’ARNm a été extrait des myotubes avec Trizol (Ambion, Carlsbad, CA), chloroforme et isopropanol. Le produit d’extraction a été lavé avec l’éthanol 75 %. L’ARNm a été dilué dans l’eau bidistillée RNAse-free et dosé avec le Biodrop (Harvard, Bioscience, MBI, Montréal, QC, Canda). Une amplification par RT-PCR a été réalisée avec programme suivant : 5 min 65°C, 2h30 min 42°C, 15 min 70°C et ∞ 4°C.

Les produits de RT-PCR ont été purifiés avec PCR-purification (Thermo Scientific, Vilnius, Lithuania) et digérés avec SwaI (NEB Inc., Ipswich, MA) et BspEI (NEB Inc., Ipswich, MA). La double digestion a été réalisée sur 500 ng du produit RT-PCR au bain-marie à 37°C pendant 16 heures. Dans le but de vérifier la qualité de la digestion, 10 µl des produits de digestion ont été utilisés pour une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % dans le tampon TBE 1X. La migration a été réalisée à 120 V pendant 30 minutes. La taille attendue du produit de la digestion est d’environ 2300 pb.

Les restes des produits de digestion ont été ensuite purifiés par gel extraction (Thermo Scientific, Vilnius Lithuania). Afin de nous assurer de la formation de l’exon hybride 50-54 dans le produit de RT-PCR, les produits de digestion purifiés ont été insérés dans le plasmide pMiniT (Biobasic, Inc. ON, Canada). Ce plasmide a été ensuite utilisé pour transformer les bactéries compétentes Top10 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Les bactéries ont été ensuite cultivées à 37°C dans LB agar avec ampicilline pendant 16 heures. Dix colonies (5 colonies pour chaque amplicons) ont été ensuite piquées et cultivées dans le LB avec ampicilline à 37°C sous agitation à 280 rpm pendant 24 heures. L’ADN plasmidique a été extrait ensuite par Miniprep (Biobasic, Inc. ON, Canada) et a été séquencé (Plateforme de séquençage et génotypage, CHUL, QC, Canada).

3. Les plasmides pCR3.1EGFPcDNADMD50-54 -1 et pCR3.1EGFPcDNADMD50-54 -2

Les cDNA50-54-1 et cDNA50-54-2 ont été amplifiés par RT-PCR, digérés avec SwaI et BspEI à 37°C pendant environ 16 heures, et purifiés. Le plasmide pCR3.1EGFPcDNADMD a aussi été digéré avec SwaI et BspEI. Les produits de digestion ont été séparés par l’électrophorèse sur gel d’agarose 1% dans le tampon TBE 1X (Tris-Borate-EDTA). Le fragment d’environ 13000 pb obtenu du plasmide pCR3.1EGFPcDNADMD et ceux

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d’environ 2300 pb dérivés des amplicons de cDNA50-54-1 et cDNA50-54-2 ont été purifiés par extraction sur gel (Fisher Scientific, Vilnius, Lithuania).

Le fragment de 13000 pb a par la suite été ligué séparément avec les fragments de 2300 bp dérivés de cDNA50-54-1 ou de cDNA50-54-2. Cette ligation a été faite avec la Quick ligase (NEB, Inc., Ipswich, MA) à la température ambiante pendant 30 minutes. Les produits de ligation ont été ensuite utilisés pour transformer les bactéries compétentes stellar (Takara Bio USA, Moutain View, CA). Les bactéries ont été cultivées dans le LB agar avec 100 µg/ml ampicilline et incubées à 30°C pendant 24 heures.

Dix très fines colonies (cinq pour chaque plasmide) ont été piquées, cultivées dans LB avec 100 µg/ml ampicilline incubées à 30°C sous agitation à 280 rpm pendant 24 heures. L’ADN plasmidique a été extrait par Miniprep (Biobasic, Inc. ON, Canada) et le séquençage a été réalisé (Plateforme de génotypage et de

séquençage, CHU, QC, Canada) avec les amorces FWhomoSwaI

(5’ATTTCAAAGAGTTTTAAATGAATTTGTTTTATGGTTGGAGGAAG 3’) et RVhomoBspEI (5’ TGGAAGCAGCTCCGGACACTTGGCTCAATGTTACTTGCC 3’). Les résultats de séquençage ont démontré une bonne insertion du fragment de 2300 pb et confirmé la présence de l’exon hybride 50-54. Nous avons produit ainsi deux plasmides, pCR3.1EGFPcDNADMD50-54-1 et pCR3.1EGFPcDNADMD50-54-2. Ces deux plasmides ainsi que le plasmide pCR3.1EGFPcDNADMD ont été utilisés pour les essais in vitro dans la lignée 293T et in vivo pour l’électroporation de souris mdx/mdx.

4. La transfection de la lignée cellulaire 293T

Au jour 0, les cellules 293T ont été cultivés dans des plaques de 24 puits à raison 104 _{cellules par puits dans} le milieu DMEM avec 10% FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37°C sous 5% de CO2. Lorsque la culture a atteint une confluence de 70-80%, les cellules 293T ont été transfectées avec 500 ng de plasmide et 2 µl de Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific, Carlsbad, CA) dilués dans 250 µl d’Opti-Mem (Gibco, Life technologies, Grand Island, NY). 48 heures après la transfection, les cellules transfectées ainsi des cellules non transfectées (contrôle négatif) ont été récoltées. La transfection a été réalisée dans le but de vérifier in vitro l’expression des cDNA (celui complet et les deux tronqués) insérés dans les trois plasmides.

5. Extraction des protéines

Les cellules 293T traitées (fluorescence verte) et non traitées (sans aucune fluorescence) (Figure 10A) ont été récoltées après traitement à la trypsine. Elles ont ensuite été lavées deux fois avec HBSS (Hanks balanced saline solution) et ont enfin été lysées avec un mélange anti-protéase composé de PMSF (phénylméthylsulfonide fluoride) 1 mM, DTT (dithiothréitol) 1 mM, Tris-HCl 75 mM pH 7.4 et SDS (sodium dodécylsulfate) 1%. Les protéines ont été extraites par la méthode méthanol-chloroforme. Elles ont été

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réduites dans le tampon SDS-glycérol-β-mercaptoéthanol-bromophénol après une ébullition à 95°C pendant 5 minutes. Les protéines ont été colorées avec amido black et dosées avec Image BioRad.

6. WB pour la mise en évidence de la dystrophine-EGFP

Les protéines extraites des cellules traitées et non traitées (contrôle négatif) ont été séparées par l’électrophorèse sur le gel de polyacrylamide 6% sous 100 V pendant 7 heures dans le tampon Tris-glycine- SDS. Le transfert a été réalisé sur la membrane nitrocellulose (BIORAD, Hercules, CA) avec le tampon Tris- glycine-SDS-méthanol 20 % sous une tension de tension de 20 V pendant 18 heures à 4°C. La membrane a été rincée 5 fois avec l’eau distillée et colorée avec Ponceau S pendant 10 minutes à la température ambiante. La membrane a été ensuite lavée avec l’eau distillée pour confirmer le transfert des protéines du gel de polyacrylamide vers la membrane de nitrocellulose. Le blocage a été réalisé avec 5% de lait et 0,05% de Tween 20 dans le tampon PBS 0,1X pendant une heure à la température ambiante. L’anticorps primaire anti- dystrophine humaine (NCL-DYS2 Novocastra) de souris (Leica Biosystems, Newcastle, UK) a été dilué dans le tampon de blocage à 1:50 et a été incubé avec la membrane pendant 18 heures à 4°C sous une agitation douce à l’abri de la lumière. La membrane a ensuite été lavée 3 fois 10 minutes avec PBS 0,1X et 0,05% de Tween 20. L’anticorps secondaire de lapin anti-souris couplé à HRP (Horse Radish Peroxydase) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA) a été dilué à 1:2500 dans le tampon de blocage. L’anticorps secondaire dilué a été mis en contact avec la membrane pendant une heure à la température ambiante. Elle a été ensuite lavée 3 fois 10 minutes avec le tampon PBS 0,1X et 0,05% de Tween 20. Le mélange Luminol et péroxyde d’hydrogène (1V+ 1V) (BioRad, Holliston, CA) a été mis en contact avec la membrane pendant 4 minutes et la révélation a été réalisée avec le film Hyblot CL (Denvile Scientific Inc. Holliston, MA) après une exposition de 5 minutes.

7. Électroporation des souris mdx/mdx

Les plasmides pCR3.1EGFPcDNADMD, pCR3.1EGFPcDNADMD50-54-1 et pCR3.1EGFPcDNADMD50-54-2 ont été électroporés aux TA souris dystrophiques mdx/mdx. 40 µg de chaque plasmide dilués dans l’eau bidistillée ont été mélangés avec 30 µl de tampon Tyrode (Sigma-Aldrich) (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 6 g/l de glucose). Le pH du tampon a été ajusté à 7.4 avec NaOH. Les souris ont été électroporées avec Electro Square Porator (ECM630, BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA) après avoir procédé à une injection des plasmides dans le Tibialis anterior. Cette injection était transcutanée et longitudinale. Un crème électrolyte (Teca, Pleasantville, NY) a été appliqué sur la peau rasée pour faciliter le passage du courant entre les deux électrodes. Les muscles ont été soumis un champ électrique (8 pulsations de 20 ms pendant une seconde). La tension a été réglée à 100 V/cm en fonction de la taille du muscle de la souris.

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8. Le traitement des tissus et histochimie

Les souris mdx/mdx électroporées ont été sacrifiées 10 jours après l’électroporation. Une souris mdx/mdx non électroporée (contrôle négatif) a été également sacrifiée. Les TA des souris ont été extraits et gardés dans la glace. Les muscles ont été ensuite enrobés de la cryorésine Tissue Plus (Fisher Health Care, Scigen Scientific, Gardena, CA) et plongés dans l’azote liquide pendant quelques minutes. Les échantillons ont été ensuite gardés à -80°C. Les coupes de tissus ont effectués avec le cryostat Leica CM 3050 (Leica Instruments GmbH, Heidelberger, Germany).

Les coupes des tissus ont été lavées avec PBS 1X pendant 5 minutes sous agitation. La fixation a été réalisée avec PFA (paraformaldehyde) 4% pendant 10 minutes sous agitation. Les lames ont été lavées avec PBS 1X deux fois 5 minutes. Le montage de lamelle couvre-objet a été réalisé avec le glycérol 50% dans PBS 1X. Les lames ont été ensuite examinées au microscope pour mettre en évidence la dystrophine fusionnée avec EGFP (fluorescence verte).