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Foram realizadas nove visitas ao laboratório para a coleta dos dados. Após a assinatura do TCLE, no primeiro dia, foram realizadas a avaliação antropométrica e as medidas das condições basais de modulação autonômica, por meio da análise da variabilidade da frequência cardíaca. No segundo dia foi aplicado o protocolo em rampa, individualizado a cada participante em esteira motorizada (EM) para obtenção dos dados de VO2máx, limiares ventilatórios 1 (LV1) e 2 (LV2) (MYERS et al., 1992). Ainda no segundo dia, ao final das intervenções, o avaliado realizou a primeira

adaptação à esteira rolante não motorizada (ENM) por meio de dez acelerações máximas de 10 segundos, tendo por base protocolos desenvolvidos anteriormente nesse mesmo ergômetro (GAMA et al., 2016, GAMA et al., 2018). Na terceira visita foi realizado o teste de uma repetição máxima

(1RM) de membros inferiores com agachamento em barra livre para determinação das cargas de pré-ativação e obtenção da medida de força máxima de membros inferiores dos voluntários, além da segunda sessão de adaptação a ENM, que aconteceu após o teste de 1RM para evitar interferências nos resultados (Figura 1). A ausência de familiarização específica ao teste de 3MT foi proposital, uma vez que se esperava que os avaliados tivessem experiência inédita ao protocolo, permitindo identificar parâmetros de controle central frente a tarefa desconhecida. Após essa fase, foram utilizados mais seis dias.

Figura 1. Representação do desenho experimental da pesquisa das primeiras três visitas nas quais

foram realizados a assinatura do TCLE, avaliação antropométrica e coleta dos dados basais dos intervalos R-R para análise da VFC dos voluntários na visita 1, teste em rampa e primeira adaptação a ENM na visita 2 e teste de 1 repetição máxima de agachamento e segunda adaptação a ENM na visita 3.

Nos próximos quatro dias de teste, os voluntários realizaram os testes de 3MT em diferentes condições, de forma cega e randomizada para as quatro condições de aplicação do protocolo (Figura 2). A primeira condição foi sem o conhecimento prévio do tempo de teste máximo que iria realizar, porém com um aquecimento convencional, que consistiu em cinco minutos de caminhada em intensidade de 6 km/h na EM da marca Inbramed (Modelo Super ATL, Brasil) (3MT SCT AN). A segunda condição consistiu na realização do 3MT com conhecimento do tempo e aquecimento convencional (3MT CCT AN). A terceira e a quarta condição de aplicação de 3MT foram as mesmas anteriores, porém realizando a pré-ativação neuromuscular após o aquecimento padrão, que foi apenas chamada pelo avaliador de um método diferente de aquecimento (3MT SCT PAP e 3MT CCT PAP).

Figura 2. Representação do desenho experimental da pesquisa para as quatro condições de

aplicação de 3MT. Visita 4 realizada sem conhecimento do tempo e aquecimento normal (3MT SCT AN), visita 5 realizada com conhecimento do tempo e aquecimento normal (3MT CCT AN), visita 6 realizada sem conhecimento do tempo e pré-ativação neuromuscular (3MT SCT PAP) e visita 7 realizada com conhecimento do tempo e pré-ativação neuromuscular (3MT CCT PAP).

Antes das quatro aplicações de 3MT também foi verificado o comportamento da variabilidade da frequência cardíaca em repouso. É importante ressaltar que houve uma padronização na maneira de comunicação com os voluntários para informações sobre as tarefas que iriam realizar, os quais eram esclarecidas sempre da mesma forma. Essas informações foram dadas obrigatóriamente nos momentos antes de serem mensuradas a pressão arterial e a VFC pré testes dos indivíduos. O voluntário era conduzido até a sala de coletas de VFC para que ficassse isolado e o avaliador comunicava o tipo de aquecimento que seria realizado (AN ou PAP), descrevendo-os como aquecimento normal ou diferenciado, e que esse aquecimento seria prévio a realização de um teste máximo na ENM com tempos desconhecidos nas condições 1 e 3, ou tempos de três minutos nas condiçõses 2 e 4. Para todas as condições, a tarefa solicitada foi desenvolver a maior velocidade possível na ENM, sendo que houve incentivo verbal similar em todos os casos. Em nenhum momento o termo PAP, pré-ativação ou qualquer outra informação que pudesse condicionar o

avaliado foi mencionado, no sentido de evitar viés de expectativa de desempenho. Os avaliados só tiveram confirmações sobre os tempos reais (nos casos em que os mesmos foram indefinidos) dos testes que realizaram ao final de todo o período de coleta. Importante destacar aqui que, conhecendo o tempo da tarefa ou não, esse sempre foi de 3 minutos. O objetivo dessa ocultação foi impedir estratégias de esforço, por parte do sujeito, para completar os 180s, visando dessa forma também testar esse aspecto no 3MT (conforme descrito no item objetivos).

Os últimos dois dias de visita ao laboratório foram utilizados para os testes de impulsão vertical bipodal contra movimento, realizados por meio de saltos em plataforma de força adaptada na ENM, precedidos de aquecimento normal na penúltima visita (SALTO VERTICAL AN) e, na última sessão, do protocolo de pré-ativação neuromuscular (SALTO VERTICAL PAP) (figura 3).

Figura 3. Representação do desenho experimental da pesquisa para as condições de aplicação do

salto vertical bipodal contra movimento. Sessão 8 realizada com aquecimento normal e salto vertical contra movimento (SALTO VERTICAL AN) e sessão 9 realizada com pré-ativação neuromuscular e salto vertical contra movimento (SALTO VERTICAL PAP).

Após todos os testes também foram aplicados questionários de Percepção subjetiva de cansaço (PSC) (BORG, 1982), Percepção subjetiva de esforço (PSE) (FOSTER et al., 2001) e de

Escala de afetividade (EA) (HARDY e REJESKI, 1989). Os participantes também foram questionados

conhecimento do tempo, os sujeitos reportaram ao final qual o tempo que eles acreditaram ter realizado a tarefa.

Foi respeitado um intervalo mínimo de 48 horas entre a aplicação de todos os testes para cada indivíduo (DASSONVILLE et al., 1998). Os protocolos foram realizados com condições de

temperatura e de umidade do ar controladas (~23ᵒC e umidade com média de 51%).

6.2.1. Avaliação antropométrica

A avaliação antropométrica foi realizada para caracterização da amostra. Foram obtidos os valores de massa por meio da balança (TOLEDO® modelo 2098 coluna 1,0m), de estatura (estadiômetro vertical), e de gordura corporal com um adipômetro científico Sanny® utilizando o protocolo de quatro dobras cutâneas (JACKSON e POLLOCK, 1978).

6.2.2. Amostras sanguíneas

Amostras sanguíneas foram coletadas do lóbulo da orelha para análise de condições basais e intervenções dos testes. Nos dias de testes foram extraídos em sete momentos diferentes. A primeira coleta foi realizada em repouso, a segunda após aquecimento, a terceira imediatamente ao final da sessão de esforço, e as demais após transcorrerem 1, 3, 5, 7 e 9 minutos pós-esforço. Durante a coleta de repouso uma quantidade maior de sangue foi extraída para que uma parte fosse destinada à análise da concentração sanguínea basal de CK (200µL) pré teste e uma menor porção para a concentração basal de lactato sanguineo (25µL) pré teste. Para a análise da concentração do lactato sanguíneo nesse e nos demais momentos, foram coletados volumes de 25µL de sangue com a utilização de capilares heparinizados e calibrados, sendo as amostras posteriormente depositadas em tubos Eppendorf contendo 50µL de NaF 1% e congeladas, para posterior leitura em lactímetro YSI 2300 (STAT PLUS). Para a análise da concentração sanguínea de CK, tanto no momento do repouso, assim como 24h após a aplicação do teste, foram então coletados quatro capilares heparinizados cheios de sangue (200µL) que foram transferidos para um tubo Eppendorf (1,5mL) sem nenhuma substância anti-coagulante. Para minimizar a ação coagulante da heparina existente nos capilares, esse sangue foi imediatamente centrifugado durante cinco minutos em uma

rotação de 3000 rpm para posterior extração de 20 µL do soro, e armazenamento em refrigerador para posterior análise da concentração sanguínea de CK. A amostra é estável por 24 horas entre 15 e 30°C, uma semana entre 2 e 8°C, e 30 dias à -20°C. Por ser esse volume de sangue pequeno, não foram acarretadas alterações sistêmicas ao avaliado.

6.2.3. Frequência cardíaca (FC) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC)

Os valores de frequência cardíaca (HR) e dos intervalos R-R dos participantes foram registrados (batimento a batimento) por meio da utilização de monitores cardíacos da marca Polar® modelo RS800CX durante o repouso (VFC) e ao longo de todos os testes (FC).

Durante a primeira visita, os participantes foram levados a conhecer a sala de coleta de dados onde foram coletadas e registradas a FC, os intervalos R-R e a pressão arterial dos mesmos para serem utilizadas como referência. Em relação a coleta dos intervalos R-R, no dia anterior e no dia das coletas de dados experimentais, os participantes do estudo foram orientados a: (a) não realizarem atividade física vigorosa; (b) não ingerirem bebidas e ou alimentos estimulantes (café, refrigerantes a base de cola, energéticos, chocolates, barras energéticas) e; (c) terem uma boa noite de sono. Todas as visitas do protocolo experimental foram agendadas para o período da tarde entre às 13:00 e 18:00 horas para evitar influências do ciclo circadiano. As avaliações foram realizadas em um ambiente climatizado artificialmente, com temperatura entre 22 e 24°C e umidade relativa do ar entre 30 e 60%. Em todas as etapas da coleta de dados da atividade cardíaca do estudo, o cronômetro foi sincronizado no tempo com o cardiofrequencímetro e a frequência respiratória medida por minuto. Para isso foi observado e registrado pelo avaliador o movimento do tórax dos participantes em cada minuto durante os 16 minutos de coleta. Somente os dados dos avaliados que apresentaram frequência respiratória acima de 12 vezes por minuto foram considerados e analisados (TASKFORCE, 1996).

Para a avaliação da VFC os participantes foram levados individualmente à sala de coleta, previamente checada quanto as condições de temperatura e umidade relativa do ar. Primeiramente, foi verificado se os participantes seguiram as orientações prévias para realização da coleta de dados. No caso de resposta negativa, foram orientados a retornar em outro agendamento. No caso de resposta afirmativa, foram mensuradas a pressão arterial em posição sentado e a frequência cardíaca em repouso em posição supinada. Foram acopladas ao avaliado as cintas elásticas com receptor de

frequência cardíaca na cintura torácica na altura do processo xifoide e a comunicação com o cardiofrequencímetro foi testada.

Estando cumpridos todos os pré-requisitos para a coleta de dados de intervalos R-R, os avaliados receberam instruções para que permanecessem quietos, sem falar e sem adormecer durante os procedimentos. A luminosidade foi reduzida ao máximo e não houve trânsito de pessoas. Silêncio absoluto foi também mantido de forma a não haver nenhuma interferência de estímulos ambientais aos dados. Após permanecerem por 3 minutos deitados, para que a frequência cardíaca se estabilizasse nesta posição, o pesquisador sincronizou um cronômetro com o tempo do relógio monitor para iniciar a coleta de registros dos intervalor R-R.

Os avaliados receberam a informação de que coleta de dados deveria acontecer na posição deitada em decúbito dorsal (posição supinada) e teria duração de 8 minutos.

6.2.4. Mensuração dos parametros respiratórios

O consumo de oxigênio (VO2) e a produção de gás carbônico (VCO2) foram aferidos constinuamente ao longo do teste de rampa, e durante as quatro aplicações de 3MT por meio da utilização do analisador de gases (Cosmed Italy K4b²). Foram consideradas as medidas do K4b2 integrado ao sistema online de captação de dados breath-by-breath o qual foi previamente calibrado em cada dia de teste. A respiração ocorreu em circuito aberto por meio de uma máscara respiratória capaz de registrar a ventilação pulmonar e a coletar amostras conhecidas dos gases foram exalados (O2 e CO2), permitindo estabelecer o consumo de O2 e a produção de CO2.

Dessa maneira, utilizando bobina bidirecional, foram obtidos registros do consumo de oxigênio (VO2 - L/min), produção de gás carbônico (VCO2 - L/min)) e ventilação-minuto (VE - L/min) e os equivalentes ventilatórios de O2 e CO2 (VE/VO2 e VE/VCO2). Baseado na análise dos dados, foram determinados os parâmetros ventilatórios de consumo de oxigênio máximo (VO2max), limiar ventilatório 1 (LV1) e limiar ventilatório 2 (LV2) no teste de Rampa. A espirometria durante 3MT foi necessária para determinar o percentual de utilização dos três metabolismos energéticos (anaeróbios e aeróbio).

O cálculo das contribuições energéticas oxidativa (aeróbia), anaeróbia lática e anaeróbia alática foi realizado nas quatro aplicaçõe de 3MT com a finalidade de investigar possíveis diferenças sobre o recrutamento metabólico entre as condições, nos efeitos

conhecimento do tempo e PAP. Para isso, os dados obtidos foram inseridos como parâmetros de entrada, usando software livre GEDAE-LAB (BERTUZZI et al., 2016), o

qual utiliza os dados obtidos pelos valores de consumo de oxigênio de repouso, consumo de oxigênio durante as diferentes aplicações de 3MT, o consumo de oxigênio após os esforços e os valores de concentração sanguínea máxima de lactato mensurada após o esforço (mmol/L). Mais detalhes sobre tais métodos de obtenção serão descritos na sessão de análise de dados do presente documento.

6.2.5. Protocolo em rampa individualizado

O protocolo em rampa individualizado em esteira foi realizado sem inclinação, velocidade inicial de 8 km/h e aumento constante da velocidade em uma taxa entre 0,7 e 1 km/h/min. O cálculo da taxa de incremento da velocidade foi realizado de acordo com o proposto por Myers et al. (1992) a partir de: 1) predição do consumo máximo de oxigênio (VO2máx); 2) cálculo da velocidade relativa ao VO2máx e 3) tempo de duração do teste estimado em 10 min. Todos os cálculos foram realizados com base nas fórmulas sugeridas por meio do programa da esteira ergométrica (American College of Sports Medicine Position Stand - "The recommended quantity and quality of exercise for developing and maintaining cardiorespiratory and muscular fitness, and flexibility in healthy adults", 1998). Durante todo o teste, a frequência cardíaca, ventilação e a concentração dos gases expirados foram continuamente mensuradas por meio do analisador de gases K4b2 (Cosmed, Italy). O final do teste foi definido por um ou mais dos seguintes critérios: 1) alcance do plateau do VO2 em dois minutos (aumento menor que 1,5 ml/kg/min); 2) alcance da frequência cardíaca máxima predita; e/ou 3) desistência voluntária.

Os dados de VO2, VCO2, VE e os equivalentes ventilatórios de O2 e CO2 (VE/VO2 e VE/VCO2) foram processados por média móvel a cada 15 pontos, com os dados centralizados no intervalo de tempo do oitavo ponto. Este procedimento teve como objetivo reduzir cerca de 90 % do erro de variabilidade inerente a qualquer sistema de análise de gases breath-by-breath (ROBERGS et al., 2010).

O VO2max foi considerado como o maior valor médio de 15 pontos obtido durante todo o teste (ROBERGS et al., 2010). O LV1 foi determinado como o primeiro aumento da VE/VO2,

enquanto que o LV2 foi determinado a partir do aumento da VE/VCO2 ou por um segundo aumento desproporcional da VE/VO2 (SMITH et al., 2009).

6.2.6. Protocolo de all-out de 3 minutos (3MT)

No teste de 3MT, os participantes executaram de forma cega e randomizada as quatro condições de aplicação de 3MT, a saber 1) realizada sem conhecimento do tempo e aquecimento normal (3MT SCT AN); 2) realizada com o conhecimento do tempo e aquecimento normal (3MT CCT AN); 3) realizada sem conhecimento do tempo e pré-ativação neuromuscular (3MT SCT PAP) e; 4) realizada com conhecimento do tempo e pré-ativação neuromuscular (3MT CCT PAP). As quatro condições do teste de 3MT foram realizadas em ENM, com o cinto ajustado na cintura e ligado diretamente ao cabo de aço acoplado na célula de carga (CSL/ZL-250, MK Controle e Instrumentação Ltda.®) fixada em poste de altura regulável. Para obtenção da força vertical foi utilizado um sistema desenvolvido no laboratório por Sousa (2017), no qual os sinais das quatro células de carga (CSR-500, MK controle e instrumentação, SP, Brasil) posicionadas equidistantemente na base da esteira foram integrados, sendo calibrados com massas conhecidas diariamente antes das coletas de dados. Para o procedimento de calibração, as massas foram posicionados no centro geométrico entre os quatro sensores da base da esteira. Uma reta de calibração individual para cada uma das células de carga foi construída diariamente por conversão dos sinais em voltagem para unidades de força. Em seguida, para cálculo da força vertical, foi utilizada a média dos valores de força registrados por cada uma dos quatro sensores. Uma função construída em ambiente MatLab calculou a força resultante como a raiz das somas dos quadrados das componentes vertical e horizontal, respeitando o princípio do teorema de Pitágoras. A força resultante seria a hipotenusa do triângulo formado entre ela mesma e as projeções das forças horizontal e vertical. Isso permitiu o cálculo do módulo dessa força a partir de: Fresultante2 = Fhorizontal2 + Fvertical2. A potência resultante foi então obtida como o produto entre a força resultante e a velocidade realizada na esteira. A velocidade do indivíduo na ENM foi determinada por um sensor de efeito hall e um ímã, localizados no cilindro (rolo) anterior da ENM. A frequência de aquisição de dados foi de 1000 Hz para os sensores de

força e essa frequência foi sincronizada com os dados obtidos pelo sensor de efeito hall, de maneira a permitir a integração dos sinais de força e velocidade nessa frequência escolhida.

Tanto as células de carga como o sensor de efeito hall emitem sinais que são modulados por meio de um condicionador de sinais (USB-6008, National Instruments®). Estes foram captados por um computador com software específico (LabView Signal Express 2009, National Instruments®) na frequência citada. Os dados obtidos por esse sistema, durante os testes, foram posteriormente transferidos para ambiente MatLab (MatLab® R2008a, MathWorkstm), onde as informações em milivolts (mV), geradas por ambos os sensores, foram tratadas para serem então interpretadas e transformadas em unidades das força (newton), e velocidade (m/s). É importante ressaltar que a calibração de todas as células de carga foi executada antes do cada um dos testes aplicados na pesquisa.

Dado o sinal de início do protocolo o participante foi orientado a correr na maior intensidade possível nesse sistema atado. O sucesso da sessão de teste ocorreu apenas quando o voluntário conseguiu finalizar os três minutos propostos controlado sempre pelo avaliador. Os indivíduos receberam encorajamento verbal constante, mas não foram informados de forma alguma o tempo decorrido durante cada execução.

6.2.7. Protocolo de determinação de uma repetição mpaxima (1RM)

Esse protocolo consistiu na realização de agachamento livre com barra apoiada nos ombros, onde o voluntário precisaria conseguir realizar flexão de joelhos até um angulo de noventa graus, medido por um goniômetro (WCS da marca Cardiomed), e subir retornando até a posição inicial de extensão completa dos membros inferiores e tronco, sem conseguir realizar o movimento com a mesma carga em uma segunda tentativa consecutiva. Cinco minutos antes do início do teste os avaliados realizaram um aquecimento na esteira motorizada por cinco minutos, sem inclinação e velocidade de 6 km/h, e na sequência, uma série de quinze repetições de agachamento livre com barra sem nenhum peso adicional (apenas o da barra, 10kg), para que o avaliador fosse capaz de analisar a qualidade do movimento. Foi estipulada uma carga inicial sugerida como referência dada pelo próprio avaliado, a qual foi referida ter sido recentemente conseguida para dez repetições do exercício específico. A partir dessa referência, foram acrescidas massas de 10 kg para cada nova

tentativa com um intervalo mínimo de três minutos, até ser encontrada uma carga na qual o indivíduo não fosse capaz de realizar o segundo movimento completo. Foi estipulado um máximo de cinco tentativas por dia de teste, caso a carga de 1RM não fosse encontrada nessas cinco tentativas, o avaliado deveria voltar para uma nova sessão de determinação (VANDERKA et al.,

2016).

6.2.8. Protocolo de pré-ativação neuromuscular ou potenciação pós ativação (PAP)

A pré-ativação neuromuscular consistiu na realização de um aquecimento normal de cinco minutos de caminhada na esteira motorizada (6 km/h) sucedida de duas séries de seis repetições de agachamento com a barra, com dois minutos de intervalo entre elas que aconteceram cinco minutos antes da aplicação do teste de 3MT e do salto contra movimento nessa condição (VANDERKA et al.,

2016). As séries de agachamento foram realizadas com carga 60% de 1RM (WILSON et al., 2013),

que foi escolhida pelos avaliadores no sentido de preservar os avaliados, uma vez que o teste de 3MT é um esforço extremanete exaustivo. Foi definido o intervalo de cinco minutos entre a PAP e os testes fundamentado nos estudos recentes que apontam ser um tempo ótimo para que não se perca o efeito da ativação neuromuscular e para que garantir que ocorra a regeneração das reservas energéticas (GOTAS et al., 2016). A opção pela utilização do agachamento como método de PAP se deu pelo fato de ser um movimento multiarticular e que proporciona ativação de musculaturas específicas que também são recrutadas no movimento da corrida como os glúteos, quadríceps femoral, musculatura abdominal e gastrocnemios. Considerando, ainda, que a ENM fornece parametros mecânicos de potência de maneira fracionada nas contribuições de força e velocidade, o exercício resistido como método de PAP possibilita maior direcionamento na investigação desses parametros e suas consequências fisiológicas e mecânicas no desempenho e na fadiga.

6.2.9. Protocolo de saltos para impulsão vertical (IV)

Os voluntários realizaram três saltos bipodais contra movimento, braços livres ao lado do