Evaluations réalisées à la station biologique de Roscoff

La plateforme de criblage d’inhibiteurs de kinases (KISSf) est implantée au sein de la Station biologique de Roscoff et est sous la responsabilité du Dr Sandrine Ruchaud. Elle offre un service d'évaluation à moyen débit (2500 composés/jour) de la bioactivité de composés chimiques. Les propriétés thérapeutiques des molécules sont évaluées sur les kinases CDK5, GSK3, DYRK1A, CK1 et CLK1.

a. Mesure de l’activité des kinases

L’activité des kinases est mesurée au sein de tampons appropriés avec leurs substrats correspondants, pendant 30 minutes à 30°C à une concentration précise d’ATP radiomarquée à l’isotope 33 du phosphore. Après incubation, les aliquotes de surnageant sont déposées sur des papiers de phosphocellulose P81. Après traitement, ces papiers font l’objet d’un comptage en présence d’un fluide de scintillation permettant de déterminer le taux de phosphate de l’ATP transféré et par la même, l’activité catalytique de l’enzyme. Les valeurs des blancs sont soustraites et les activités sont exprimées en pourcentage d’activité maximale (en l’absence de l’inhibiteur). Les témoins sont réalisés avec les concentrations appropriées de DMSO. Les courbes dose-réponse sont déterminées à 6 concentrations différentes de l’inhibiteur potentiel de 0.05 à 10 μM. Les valeurs des IC50 sont calculées à partir de ces courbes par le logiciel Sigma-plots.

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1) CDK5/p25

CDK5/p25 est reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDK5 et p25 de mammifère recombinante exprimées chez Escherichia coli sous forme de protéines de fusion GST (Glutathione-S-Transférase) et purifiées par chromatographie d’affinité sur glutathione-agarose. L’activité de CDK5 est mesurée en présence de son substrat histone H1.

2) GSK3 α/β

GSK3 α/β est purifiée à partir de cerveau de porc par chromatographie d’affinité sur bille d’axine. Son activité catalytique est évaluée en présence de son substrat spécifique la glycogène synthase (GS1: YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQpSEDEEE).

3) CK1 δ/ε

CK1 δ/ε est purifiée à partir de cerveau de porc par chromatographie d’affinité sur bille d’axine et son activité catalytique est évaluée en présence de son substrat peptidique : RRKHAAIGpSAYSITA.

4) DYRK1A

La DYRK1A recombinante de mammifère est exprimée chez Escherichia coli sous forme de protéines de fusion GST (Glutathione-S-Transférase) puis purifiée par chromatographie d’affinité sur glutathione-agarose. Son activité est mesurée en présence de son peptide substrat Woodtide (KKISGRL-SPIMTEQ).

5) CLK1

La CLK1 recombinante humaine est exprimée chez Escherichia coli sous forme de protéines de fusion GST (Glutathione-S-Transférase) et son activité est évaluée en présence du peptide (RS peptide (GRSRSRSRSRSR)).

b. Evaluations réalisées au CBM

L’équipe du Dr Hélène Bénedetti au Centre de Biophysique Moléculaire (CBM) d’Orléans dispose d’un plateau de criblage pour réaliser des tests d’activité inhibitrice sur plusieurs kinases des voies de signalisation cellulaire dont Pi3k.

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sur l’isoforme Pi3k α humaine³⁰¹. Le capillaire est utilisé comme nanoréacteur à travers

duquel les solutions de Pi3k α, de son substrat phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PIP2), de

l’ATP et du potentiel inhibiteur sont injectées séparément. Les réactifs sont mélangés par une approche de TDLFP (profil de diffusion transversal à flux laminaire). L’ADP formée par l’activité catalytique de Pi3k α est séparée des autres réactifs par un champ électrique. L’absorption UV de l’ADP est ensuite quantifiée à 254 nM. L’activité enzymatique est définie comme étant le ratio de la surface du pic corrigée (air du pic divisée par le temps de migration) de l’ADP en présence et en l’absence de l’inhibiteur.

c. Evaluations réalisées à ImPACcell

La plate-forme ImPACcell (Imagerie Pour Analyse du Contenu cellulaire) réalise des études biologiques à partir d’images de cellules en culture par microscopie à fluorescence. Elle a pour objectif de déterminer l’effet inhibiteur sur la croissance cellulaire ou l’effet toxique d’une molécule. Elle détermine également les activités biologiques pour les molécules testées. La plateforme ImPACcell est composée de trois plateaux :

- Un plateau de microscopie automatisée pour l’acquisition et l’analyse d’images multiparamétriques à partir de coupes de tissus sur lames ou de cellules en cultures. - Un plateau de tests biologiques adaptés à l’analyse d’images, incluant des marqueurs

du cycle cellulaire et de la prolifération, de la plasticité et de la motilité cellulaire, du vieillissement et de la mort cellulaire.

- Un plateau de screening de facteurs exogènes et de molécules à visée thérapeutique, basé sur l’étude comparative de modèles cellulaires représentatifs de tissus ciblés ou de tumeurs chez l’homme ainsi que sur la recherche de cytotoxicité et d’activités biologiques.

Parmi les lignées de cellules disponibles au sein de cette plate-forme de criblage, nos molécules ont été évaluées sur 7 lignées de cellules cancéreuses provenant de la collection ECACC : Huh 7 (hépatocarcinome), Caco2 (adénocarcinome colo-rectal), MDA (adénocarcinome du sein), HCT116 (adénocarcinome du colon), PC3 (adénocarcinome de la prostate), NCI (cancer du poumon), HaCat (kératinocytes immortelles) et une lignée de

(301) Nehmé, R.; Nehmé, H.; Saurat, T.; de-Tauzia, M.-L.; Buron, F.; Lafite, P.; Verrelle, P.; Chautard, E.; Morin, P.; Routier, S.; Bénédetti, H. New in-Capillary Electrophoretic Kinase Assays to Evaluate Inhibitors of the PI3k/Akt/mTOR Signaling Pathway. Anal.

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cellules diploïdes fibroblastiques provenant de la société BIOPREDICT (Rennes). Les fibroblastes sont des cellules de peaux normales utilisées comme contrôle de toxicité aspécifique. Nos molécules ont été évaluées à deux niveaux :

- un premier niveau de screening basé sur la recherche d’un effet toxique aspécifique et la mesure de l’efficacité bioactive des molécules par l’établissement d’une gamme dose-réponse (IC50) comparative sur les différentes lignées cellulaires.

- un deuxième niveau de screening visant à identifier ou confirmer l’effet bioactif ciblé par la réalisation des tests biologiques appropriés (BrDu et index mitotique).

1) Mesure de la toxicité

Les cellules sont cultivées selon les recommandations de l’ECACC. Le test de toxicité des

molécules sur les cellules est réalisé selon le protocole suivant : 2.10³ cellules de HCT116 ou

4.103 des autres lignées cellulaires sont ensemencées dans les plaques 96 puits et laissées 24 h pour adhérer, coloniser et croitre. Ensuite, les cellules sont exposées soit à une concentration unique de 25μM de la molécule (premier screening à dose unique) soit à des concentrations croissantes de la molécule (de 0.1 à 25μM) pour la mesure de l’IC50. Les cellules sont fixées avec une solution à 4% de paraformaldéhyde. Les noyaux sont colorés avec un colorant de l’ADN (Hoechst 3342) et comptés en utilisant un système d’analyse d’images automatisé. Les IC50 sont déterminées graphiquement à partir des courbes dose-réponse.

2) Mesure des marqueurs cellulaires

Mesure de la phase S

Le BrdU (5-bromo-2'-déoxyuridine) permet la détection spécifique de la phase S. C’est en effet un analogue de la thymine qui est capable d’être incorporé par les cellules en phase de réplication. Elle présente de plus des propriétés antigéniques qui peuvent être détectées par des anticorps spécifiques.

Pour l’incorporation de BrdU, 2.10³ cellules par puits pour HCT116, ou 4.10³ cellules par puits, sont ensemencées sur une plaque à 96 puits. 24h après l’ensemencement, les cellules sont exposées aux molécules. Après 48h de traitement, le BrdU est ajouté au milieu de culture pour 90 min. Après fixation avec une solution de para-formaldéhyde à 4%, les cellules sont colorées avec Hoechst 3342 et un anticorps anti-Brdu. L’acquisition et l’analyse des images sont réalisées automatiquement (Cellomics ArrayScan VTI/HCS Reader). Le pourcentage de

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cellules en phase S est calculé par la quantité de cellules positives au BrdU sur le total de cellules positives à Hoechts.

143 Mesure de l’index mitotique

L’index mitotique correspond au rapport entre le nombre de cellules en mitose sur le nombre de cellules totales. L’un des marqueurs de cette phase est la présence de l’histone H3 phosphorylée.

Pour mesurer cet index, 2.10³ cellules par puits pour HCT116, ou 4.10³ cellules par puits, sont ensemencées sur une plaque à 96 puits. 24h après l’ensemencement, les cellules sont exposées aux molécules. Après 24 h de traitement, les cellules sont fixées avec une solution à 4% de para-formaldéhyde et colorées avec Hoechst 3342 et l’anti-histone H3 phosphorylée. L’acquisition et l’analyse des images sont réalisées automatiquement (Cellomics ArrayScan VTI/HCS Reader). L’index mitotique est calculé comme étant le pourcentage de cellules en mitose identifiées par la coloration positive à l’histone H3 phosphorylée sur le total de cellules positives à Hoechst 3342.