Evaluation de la sélectivité des couples d’amorces sur souches fongiques pures

3.1.

Evaluation de la spécificité sur souches fongiques

La sélectivité a été évaluée pour chaque couple d’amorces en utilisant des ADN extraits d’espèces phylogénétiquement proches de leurs espèces cibles respectives. Les résultats obtenus pour chaque couple sont présentés tableau 6.

o Le couple PchQ a été testé sur des espèces représentatives des différents genres,

P.ch étant la seule espèce du genre Phaeomoniella ayant été isolée sur vigne. Le

couple s’est montré spécifique à P.chlamydospora dans nos essais (Tab. 6).

o Pour PalQ, seule la souche P.al CBS 100398 permet d’obtenir une amplification parmi les douze autres espèces testées, dont six du genre Phaeoacremonium,

P.iranianum (CBS 101357), P.viticola (CBS 101738), P. mortoniae (CBS 101585), P.austroafricanum (CBS 114993), P.parasiticum (CBS 113585), P.scolytii (CBS

113593). Aucune amplification n’est observée sur ADN extrait de plante. PalQ est donc confirmé comme étant spécifique au niveau de l’espèce (Tab. 6).

o Pour BobQ, la spécificité dans le genre Diplodia a été évaluée par rapport à

D.mutila (CBS 112553). Le couple permet de discriminer ces deux espèces (Tab.

6). D.corticola n’a pas ici été testé, au vu des mutations similaires existantes au niveau des sites d’amorçages de BobQ. La spécificité de réaction observée avec le couple BobQ devrait donc permettre d’établir un diagnostic suffisamment précis pour la détermination de l’espèce sur vigne.

o Pour BpvQ, toutes les espèces susceptibles d’être amplifiées n’ont pas été testées. Les espèces ont ici été choisies afin de refléter un nombre croissant de mutations au niveau des sites d’amorçages et ainsi évaluer l’impact de celles-ci sur la détection des espèces. B.lutea et B.eucalyptorum présentent des valeurs de Ct différentes de celles de B.parva et B.australis. Cette augmentation de la valeur du Ct, pour une même quantité d’ADN, traduit théoriquement une diminution de

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l’efficacité de la réaction. Sur la base des Ct, celle-ci est corrélée avec le nombre de mutations non-discriminantes au niveau des sites d’hybridation de BpvQF. Néanmoins, l’efficacité calculée par la méthode de la droite de calibration indique le contraire. Si par cette méthode les efficacités de la réaction pour N.parvum et

B.australis sont identiques (96,5 et 96,78%), l’efficacité observée avec N.luteum

parait supérieure (116,90%). Aucune droite de calibration n’a pu être obtenue pour N.eucalyptorum, du fait de la non-linéarité des Ct observés sur les différentes dilutions (données non-montrées). Une variation de la limite de détection est aussi observée pour N.luteum et N.eucalyptorum (5pg et 0,5ng respectivement).

o ElQ s’est aussi montré spécifique aux espèces décrites dans l’étude préliminaire. Le couple discrimine techniquement la souche E.lata CBS 208.87 de la CBS 289.87, phylogénétiquement très proche. Le couple ElQ peut donc être considéré comme spécifique au groupe décrit comme E.lata sensu stricto (Tab. 6).

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Tableau 6: Evaluation de la spécificité des couples PchQ, PalQ, BobQ, BpvQ et ElQ sur souches fongiques pures.

Espèce and isolate ElQ PchQ PalQ BpvQ BobQ

Ct Tm Ct Tm Ct Tm Ct Tm Ct Tm Contrôle négatif - - - - E.lata CBS 208.87 21,4 80,4 - - - - E.flavovirens CBS 272.87 - - E.leptoplaca CBS 286.87 - - E.lata CBS 289.87 - -

E.lata var aceris CBS 290.87 - -

P.chlamydospora CBS 239.74 - - 21,7 75,8 - - - - P.aleophilum CBS 100398 - - - - 22,2 82,1 - - - - P.iranianum CBS 101357 - - P.viticola CBS 101738 - - - - P.inflatipes CBS 101585 - - P.austroafricanum CBS 114993 - - P.parasiticum CBS 113585 - - - - P.scolytii CBS 113593 - - B.parva CBS 110301 - - - 22,0 85,2 - - B.australis CBS 119046 21,8 85,2 - - B.lutea CBS 110299 25,3 84,9 - - B.eucalyptorum CBS 115791 29,5 84,5 B.obtusa CBS 119049 - - - 20,6 84,1 B.stevensii CBS 112553 - - - - B.dothidea CBS 110302 - - - - V.vinifera R110 - - - -

V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon - - - -

Le tableau présente les résultats obtenus (Ct et Tm) sur les souches de référence des espèces sélectionnées pour ces tests. Les couples ont aussi été testés entre genre. Les tirets (-) représentent les souches pour lesquelles l’absence d’amplification et de profil de fusion ont été obtenus. Les cases vides indiquent les souches pour lesquelles les couples d’amorces n’ont pas été testés.

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3.2.

Validation de la méthode sur souches fongiques de

mêmes espèces

L’objectif a ici été de déterminer si les différentes souches étaient détectées et quantifiées de manière similaire, mais aussi d’évaluer dans quelles mesures les Tm peuvent être considérés comme des marqueurs de l’identité du produit dans nos conditions expérimentales.

3.2.1. Comparaison de la quantification des souches

Ici, une souche constitue un échantillon statistique de trois mesures. Ni l’hypothèse de normalité de distribution, ni l’hypothèse d’égalité des variances ne peuvent être ici validées sur ces échantillons. Le test non-paramétrique de Kruskal-Wallis (KW) est donc la solution statistique la mieux adaptée à l’analyse de variance de ces données.

Figure 31: Histogramme des valeurs quantitatives en nombre de copies obtenues pour 5ng d’ADN de différents isolats de mêmes espèces. Les classes déterminées par l’analyse de variance (KW) entre espèces sont indiquées par des lettres minuscules (A). Les moyennes et écart-types ont été calculés pour trois mesures.

Les nombres de copies obtenus sur les souches d’une même espèce ont d’abord été comparés avec le test de Kruskal-Wallis (KW) (Fig. 31). Les p-values obtenues sont de 0,203 ; 0,200 ; 0,413 ; 0,360 ; 0,602 pour les groupes de E.lata, P.al, P.ch, B.ob et B.pv respectivement. Les souches ne sont donc pas quantifiées de manière significativement différente (p>0,05). Une analyse de variance a donc été réalisée en considérant chaque lot d’isolat comme un échantillon. Ici le test de KW détecte qu’au moins une espèce est significativement différente des autres (p<0,001). Les échantillons ont donc fait l’objet de comparaisons multiples par paires et ont été classés par groupe (Fig. 31). P.al est significativement différent de E.lata et P.ch mais pas de B.ob et B.pv. Ces deux derniers sont

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aussi significativement différents de E.lata, mais pas de P.ch. Le plus grand nombre de copies a été noté pour E.lata avec une valeur d’environ 300 000 copies pour 5ng d’ADN. P.ch est estimé à 180 000 copies, B.ob et B.pv à environ 150 000 copies et P.al 120 000. Même si les valeurs observées sont significativement différentes entre certaines espèces, ces valeurs restent dans le même ordre de grandeur. Si l’on calcule ici le rapport du poids en matrice d’ADN sur le nombre de copies mesuré, on obtient la masse de génome pour une copie. Dans l’hypothèse où nos couples d’amorces ciblent une séquence en copie unique, la masse d’ADN par copie doit être la masse d’un génome haploïde. Les valeurs ainsi calculées sont de l’ordre de quelques dizaines de fg (28, 41, 33, 33 et 17 pour P.ch, P.al, D.se, N.pv et E.lata respectivement), et sont parfaitement comparables aux tailles des génomes connus pour d’autres champignons ascomycètes (Gregory et al., 2007).

3.2.2. Comparaison des températures médianes des produits PCR

Figure 32: Histogramme des valeurs des Tm associées aux produits d’amplification obtenus sur différents isolats de mêmes espèces.

Les Tm des produits PCR ont aussi été traitées statistiquement (Fig. 32). Il est d’abord important de noter que l’uniformité de température sur le bloc du thermocycleur utilisé est de +/- 0,5°C (données constructeur). Ici, les écarts types des trois mesures sont inférieurs ou égaux à 0,1°C pour 21 isolats sur 30. Des différences significatives (p<0,05) sont donc aisément détectées au sein des échantillons pour P.al, D.se et N.pv. Les comparaisons multiples par paires ne permettent pourtant pas de discriminer une souche de toutes les autres. Par exemple, les souches de D.se CBS119049 et Bo2 ont des Tm significativement différentes, 83,8 (+/- 0,1) et 84,2°C (+/- 0,058) respectivement, mais ne sont pas significativement différentes des Tm des autres souches. De plus, ces variations n’excèdent

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pas 0,5°C (spécification constructeur), elles ne peuvent donc pas être attribuées aux souches elles-mêmes dans nos conditions expérimentales.

Il a ici été montré que la méthode RT-qPCR développée permet une quantification similaire d’une même masse d’ADN provenant de différentes souches d’une même espèce. Il a aussi été montré que les températures médianes des produits PCR ne varient pas entre souches et peuvent donc être utilisées comme des marqueurs de la spécificité de réaction.